体外去SUMO化体系的建立及应用

王岳飞

（上海交通大学医学院 病理生理学教研室，上海 200025）

体外去SUMO化体系的建立及应用

王岳飞

（上海交通大学医学院 病理生理学教研室，上海 200025）

目的构建体外去SUMO化系统用于药物筛选。方法大肠杆菌表达人Senp2催化活性结构域即Senp2C和SUMO1化的RanGAP1△C。结果Ni2＋柱纯化获得有活力的酶Senp2C和底物蛋白质即RanGAP1△C－SUMO1。结论建立体外去SUMO化系统，可筛选影响去SUMO化活性的药物。

Senp2；SUMO1；去SUMO化；药物筛选

小泛素相关修饰因子（small ubiquitin－related modifien，SUMO）化修饰是蛋白质翻译修饰的一种重要形式。成熟形式的SUMO通过特定的SUMO化酶的作用，SUMOs的甘氨酸尾巴可以和被修饰蛋白质特定位置上赖氨酸残基的ε－氨基连接形成异肽键，对目标蛋白质进行 SUMO 化修饰［1－3］。目前为止，研究发现可以被SUMO化修饰的蛋白质已经有很多，这些蛋白质有2／3是转录因子或转录因子的辅因子。除转录调控功能外，另外发现的SUMO化蛋白质还有参与发育、细胞生长分化、蛋白质核质转运、核糖体生成、DNA 修复等生理进程［4－6］。

SUMO化修饰在体内是一个动态可逆的过程，SUMOs首先是被切除羧基末端多余氨基酸序列露出Gly－Gly尾巴，然后被连接到靶蛋白质上形成SUMO化的目标蛋白质，最后SUMO又可以从被修饰的靶蛋白质上完整的切除下来。由此形成SUMO化／去SUMO化的循环。在此循环调控中，一类称为SENPs（Sentrin－specific proteases，SENPs）的蛋白酶行使着重要的功能：①切除SUMO前体C－末端的几个氨基酸残基，以暴露c－末端的双Gly残基使之成为具有修饰、转运等功能的成熟SUMO。②将SUMO－底物蛋白质复合物水解成SUMO和底物，这个过程称为去SUMO化。哺乳动物中SENPs家族由6个成员组成，它们都属于半胱氨酸蛋白酶家族，Senp2（Sentrin－specific protease 2，Senp2）就是其中的一种，它能够催化大量蛋白质去SUMO化，同时具有极高的内肽酶活性（使SUMOs成熟）［7－8］。

对于SENPs酶活性（内肽酶、异肽酶）的研究有不少的报道，也有多种的检测体系。我们实验室应用原核表达SUMO化的蛋白质和Senp2催化活性结构域，建立体外去SUMO化体系，研究体外条件下对Senp2C的异肽酶活力可能有影响的药物分子或小分子化合物［9－10］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 原核表达质粒pET28a购自Novagen公司；RanGAP1△C－SUMOI表达质粒由程金科实验室惠赠；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）菌株购自Tiangen公司。

1.1.2 主要试剂 高保真DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶、低分子质量蛋白质标准均购自TaKaRa公司；Ni－NTA Agarose亲和柱购自Qiagen公司；质粒提取试剂盒和核酸回收试剂盒购自Sangon公司；异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（Isopropy－β－D－thiogalactoside，IPTG）购自生物工程（上海）有限公司；小牛血清白蛋白（BSA）、咪唑（imidazole）、二硫苏糖醇（DTT）、氨苄青霉素、苯甲基磺酰氟（Phenylmethyl sufonyl fluoride，PMSF）均购自碧云天公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自Sigma公司；其他试剂均均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 AKTA－purifier购自 GE公司；Bio－Rad凝胶电泳系统。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建及蛋白质的表达纯化 以前列腺癌细胞系PC3细胞cDNA为模板，PCR扩增得到人SENP2包含催化活性结构域（Catalytic domain，SENP2C）的截短体（360～589aa）编码序列。两端用Nde I和Sal I限制性酶切后与同样双酶切的pET28a载体连接，构建pET28a－SENP2C表达质粒，用于表达N－端带6His－tag的SENP2C。

pET28a－SENP2C质粒转染大肠杆菌 BL21（DE3）菌株，挑单克隆转接到10mL LB培养液中，37℃，300r／min，扩增菌液过夜（15h），然后按照1∶100比例转接到1LLB培养液中，37℃，300r／min，扩增菌液至OD600在0.8左右时，加入IPTG至终浓度为0.2mmol／L，27℃，260r／min，振荡培养5h，诱导SENP2C表达。诱导结束后离心收集菌液，菌体称湿重后于－80℃存放备用。纯化方法采用普通Ni柱非变性纯化过程，详见Qiagen公司技术手册。

SUMO化的RanGAP1△C的表达参考文献［11］的方法，将表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，卡那霉素与氯霉素双抗性LB平板筛选得到含2种质粒的单克隆，转接到20mL LB培养液中，37℃，300r／min，扩增菌液过夜培养，然后按照1∶100比例转接到2LLB培养液中，37℃，300r／min，扩增菌液至 OD600大于 1.0 时，加入IPTG至终浓度为0.2mmol／L，25℃，260r／min，振荡培养12h。诱导完毕后离心收集菌体，用常规Ni－NTA亲和层析获得SUMO1化的RanGAP1△C。因其中混杂未被SUMO1修饰的RanGAP1△C，所获SUMO1化蛋白质仅占Ni柱纯化样品的50%左右，所以用FPLC进行2次纯化。把Ni柱纯化得到的样品用Amicon Ultra 15超滤浓缩管浓缩置换缓冲液，上样置1mL的MonoQ柱子，A液为pH 8.0的20mmol／L Tris－HCl，B液为pH 8.0的20mmol／L Tris－HCl和1mol／L NaCl，0～0.8mol／L NaCl线性梯度洗脱。分别收集各洗脱峰，SDS－PAGE电泳检测SUMO化RanGAP1△C（40KDa）所在组分，Amicon浓缩后用体积分数为50%甘油－20℃冻存备用。

1.2.2 Senp2C异肽酶活性（去SUMO化检测） 去SUMO化反应条件为：50μL体系，25mmol／L Tris－HCl，pH 8.0，150mmol／L NaCl，1mmol／L DTT，8μg SUMO化的RanGAP1△C底物和5nmol／L Senp2C，37℃，1.5h。反应完毕后加入12.5μL 5×的SDS－PAGE上样缓冲液，95℃加热5min中止反应。然后SDS－PAGE电泳样品，考马斯亮蓝染色PAGE胶显示样品蛋白质条带，脱色后扫描仪将染色后的PAGE胶成像，用Bio－Rad Quantity One软件分析蛋白质条带的灰度值，计算SUMO化底物的消耗量及酶活力。

1.2.3 化合物抑制Senp2C去SUMO化活力检测去SUMO化反应条件为条件和检测方法同“1.2.2”项下，唯一不同的是在每个反应体系中加入一定浓度的待测小分子化合物。

2 结果

2.1 基因克隆和表达纯化

SENP2C编码序列681个核苷酸序列经测序验证插入pET28a质粒正确，经小量表达测试表明可以在大肠杆菌中正确表达有活力的Senp2C蛋白质。大量表达Ni柱亲和纯化后获得10g／L的Senp2C共1.5mL。见图1。

2.2 去SUMO化活力分析

按“1.2.2”项下方法，37℃，50μL体系中，分别加入不同浓度的Senp2C，反应1.5h，结果见图2。图2中，在Senp2C的作用下，40kDa的RanGAP1△C－SUMO1被蛋白酶切割成25kDa的RanGAP1△C和15kDa的SUMO12个肽段。可见此体外去SUMO化体系可以用于Senp2C活力检测以及筛选对Senp2C活力有影响的药物分子。

图1 SDS－PAGE检测重组表达纯化的蛋白质

图2 去SUMO化活力检测

2.3 小分子化合物对Senp2C异肽酶活力的影响

按照去SUMO化反应条件，选择了部分小分子化合物加入去SUMO化反应体系中检测其对Senp2C活力的影响，结果见图3。因为小分子化合物都溶于DMSO中，故把DMSO也作为一种化合物单独加入一个反应体系以作为对照（泳道4），同时也使用了非特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂作为阳性对照（泳道5）。通过与对照反应体系的比较可以发现实验检测的4个化合物（泳道6～9）中，1号化合物对Senp2C的去SUMO化活力有明显抑制作用，而其他3个化合物没有抑制作用。据此我们可以对1号化合物做更深入的实验分析。

图3 小分子化合物对Senp2C异肽酶活力影响

3 结论

SUMO化—去SUMO化的动态平衡对于调控细胞的稳定状态具有极其重要的作用，在体内，这是一个受到精确调控的过程。通过体外表达纯化获得Senp2C及RanGAP1△C－SUMO1，建立检测去SUMO化反应体系，在一定程度上可以模拟体内的去SUMO化过程，为我们研究体内的去SUMO化过程提供一个间接的手段。实验中我们获得了高纯度、高活力的去SUMO化酶Senp2C，也得到了酶作用的底物蛋白质SUMO 1化的RanGAP 1△C。通过不同实验条件的组合对比得到了合适的体外去SUMO化反应条件，在此体外条件下对Senp2C异肽酶活力有影响的小分子化合物进行筛选，获得了一些初步的数据。通过我们的研究发现，体外去SUMO化体系既可以用于基础研究，也能用于一些有针对性的药物开发。

［1］Bayer P，Arndt A，Metzger S，et al.Structure determination of the small ubiquitin－related modifier SUMO－1［J］.Jmol Biol，1998，280（2）：275－286.

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［4］Geiss－Friedlander R，Melchior F.Concepts in sumoylation：a decade on［J］.Nat Revmol Cell Biol，2007，8（12）：947－956.

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［8］Scheschonka A，Tang Z，Betz H.Sumoylation in neurons：nuclear and synaptic roles？［J］.Trends Neurosci，2007，30（3）：85－91.

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［10］Tatham M H，Hay R T.FRET－based in vitro assays for the analysis of SUMO protease activities［J］.Methodsmol Biol，2009（497）：253－268.

［11］Mikolajczyk J，Drag M，Békés M，et al.Small Ubiquitin－related Modifier（SUMO）－specific proteases［J］.J Biol Chem，2007，282（36）：26217－26224.

［责任编辑 姬 荷］

Establishment and application of an in vitro desumoylation system

WANG Yue－fei（Department of Pathophysiology，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200025，China）

ObjectiveTo set up in vitro desumoylation system and use it to drug screening.MethodsSenp2Cwas produce and SUMO－1－conjugated protein RanGAP1△C in Escherichia coli.ResultsRecombinant proteins were purified by Ni2＋columns.ConclusionIn vitro desumoylation system is established successful and it can used in drug screening.

Sentrin－specific protease 2；SUMO－1；Desumoylation；Drug Screening

Q78

A

1672－7606（2012）02－0121－03

2012－02－10

王岳飞（1978－），男，江西上饶人，硕士，助理实验师，从事病理生理学的教学与科研工作。