红豆杉提取物和纳米乳包裹红豆杉提取物作为流感疫苗佐剂的初步研究及其LD50的测定

李 慧 张新文 余 巍 马艳玲 赵兰华 王 俊 杨 磊 李映波

流感病毒引起的急性呼吸系统疾病传播迅速，可反复感染。预防流感大流行暴发的最有效手段是接种流感疫苗［1］。在流感疫苗中使用佐剂能够增强其免疫原性，减少单剂流感疫苗的用量，对于开发能够预防潜在的大流行流感的疫苗均具有现实意义［2］。

我国在天然植物药开发方面具备传统优势。曼地亚红豆杉(Taxusmadia)原产于美国、加拿大，是一种天然杂交品种，是美国FDA批准可以用作提取“紫杉醇”的红豆杉之一，我国自20世纪90年代引进人工繁殖成功，现在四川、广西、山东和云南等地已广泛栽培。

纳米乳剂是一种自发形成的、热力学稳定、外观透明或近似透明的体系，具有粒径小且均匀，易于制备，稳定性、流动性均较好，易于注射等优点，可作为药物载体应用于多种吸收方式的药物制剂中，是一种较为常见的疫苗佐剂候选［3］。本文在实验室前期筛选工作的基础上选取红豆杉提取物和纳米乳包裹红豆杉提取物进行灭活H3N2流感疫苗的佐剂效果研究并进一步测定了红豆杉提取物和纳米乳包裹红豆杉提取物的半数致死量(LD50)，为其用药的安全性研究提供一定参考。

材料与方法

1.实验动物:健康ICR小鼠，体重18～22g，由本所动物中心提供。实验前，将小鼠置于常温动物房中适应饲养1周，标准饲料，饮用水为自来水。

2.主要试剂和仪器:红豆杉提取物(曼地亚红豆杉的枝条和树皮，经鉴定为Taxusmadia。)由本实验室制备，纳米乳由本实验室制备，H3N2流感病毒灭活疫苗(血凝素含量为43.67μg/ml)由本实验室制备，氢氧化铝佐剂(浓度为16.31mg/ml)由中国医学科学院医学生物学研究所制备，受体破坏酶(RDE)购自日本SEIKEN公司，聚氧乙烯蓖麻油(EL)购自上海楷洋生物技术有限公司，1，2－丙二醇购自天津市化学试剂三厂，Span 80购自天津市科密欧化学世界开发中心，肉豆蔻酸异丙酯(IPM)购自上海楷洋生物技术有限公司。电子分析天平产自德国Sartorius公司，台式微型离心机产自美国Beckman公司，电热恒温水浴锅产自上海医疗器械七厂，96孔血凝板产自美国Sigma公司，电热干燥箱产自上海一恒科学仪器有限公司，磁力搅拌器为德国IKA C－MAG HS系列。

3.实验方法:(1)红豆杉提取物的制备:取红豆杉枝条置烘箱中，60℃干燥，粉碎，为红豆杉干燥粉末。将制备所得粉末与蒸馏水混合，每10g粉末与150ml蒸馏水混合，浸泡过夜后，加热回流10h，放置至室温，过滤后干燥浓缩后即可。(2)纳米乳包裹红豆杉提取物的制备:按EL∶Span80∶丙二醇∶IPM= 1∶1∶2∶2的配方于搅拌瓶中配制纳米乳试剂，将计算好剂量的红豆杉提取物(每只小鼠的红豆杉提取物注射剂量为0.2mg)溶于纳米乳剂，室温下搅拌至溶液为透明，得到以由纳米乳剂包裹的红豆杉提取物混合溶液(其质量比为红豆杉提取物∶EL∶Span80∶丙二醇∶IPM∶水=7∶1000∶1000∶2000∶2000∶1000)。(3)佐剂效果检测:①含佐剂疫苗的配制及对照组设立:本实验中每只小鼠注射剂量要求:每只小鼠注射0.2m l，含血凝素1.2μg，红豆杉提取物0.2mg。按所需剂量将红豆杉提取物溶于疫苗，配制出以红豆杉提取物为佐剂的流感疫苗。同时参照纳米乳包裹红豆杉提取物制备方法配制出以纳米乳剂包裹的红豆杉为佐剂的流感疫苗。本实验设立的对照组为:铝佐剂对照组，其中Al(OH)3含量为0.2毫克/只，血凝素含量为1.2微克/只;疫苗对照组，血凝素含量为1.2微克/只;空白对照组，生理盐水0.2毫升/只;②免疫小鼠并检测效价:将标准体重ICR雌性小鼠随机分为5组，每组7只，分别肌内注射进行初次免疫(表1)。3周后，进行第2次肌内注射免疫。初免后每隔7天采集小鼠尾动脉血，分离血清，检测血凝抑制(HI)抗体效价［4］。连续监测6周，并分别在1、21和70天时称取小鼠体重，观测佐剂对小鼠生长的影响。重复实验。(4)佐剂的LD50测试:①预实验:找出0(Dn)和100%(Dm)估计致死剂量。根据体重将小鼠随机分组，每组5只。禁食24h，不禁水。24h后开始进行预实验。配制系列浓度的药液，对小鼠进行一次性腹腔注射，连续观察7天，每天观察4次，记录动物的死亡情况。以小鼠呼吸、心跳停止为LD50的观察指标。重复预实验，确定红豆杉提取物Dm、Dn分别为500和188.5mg/ kg，纳米乳包裹红豆杉提取物Dm、Dn分别为9.5和5.6g/kg;②正式实验:根据预实验得到的数据，按1∶0.8分别计算红豆杉提取物实验和纳米乳包裹红豆杉提取物实验中各组给药剂量(表3、表4)。各组动物禁食24h后按照各组给药剂量一次性腹腔注射给药，给药后饲喂全价日粮，密切观察7天并记录实验结果。

4.统计学方法:采用SASV9.1，SPSS V13.0软件进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.红豆杉提取物和纳米乳包裹红豆杉提取物对H3N2流感疫苗的佐剂效果:各组HI抗体效价见表1。由表1和图1观察到，免疫后，红豆杉佐剂组的抗体效价一直高于疫苗组3～12倍，纳米乳包裹红豆杉佐剂组的抗体效价一直高于疫苗组4～16倍。14和21天的抗体效价均高于铝佐剂组，表明二者的免疫增强作用先于铝佐剂产生。这可能是因为铝佐剂可以降低某些抗原的反应原性从而推迟了早期抗体的产生;而纳米佐剂均匀性好，包裹或吸附的抗原颗粒恰好是巨噬细胞(MΦ)和树突状细胞(DC)的首选吞噬目标，在诱导疫苗体液免疫应答的早期优于 Al (OH)3佐剂，能够快速地激活和提高被免疫小鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答水平［5］。在28天时，纳米乳包裹红豆杉提取物佐剂组与铝佐剂组达到相同的抗体效价水平，而之后的下降幅度较铝佐剂组缓和，在35天仍高于铝佐剂组(图2)。同时，由始至终纳米乳包裹红豆杉佐剂组的效价一直高于单纯红豆杉佐剂组。这可能是因为纳米乳可以增强了红豆杉的免疫活性，促进了Th1型和Th2型免疫应答，诱导了细胞免疫和体液免疫的发生，而铝佐剂只能够激发Th2型的体液免疫。同时，纳米乳粒径小，表面积大，包裹红豆杉后提高了红豆杉的生物利用度，减少了红豆杉的使用剂量，并延缓了红豆杉的释放，延长了药物刺激抗体产生的时间使机体产生长效的免疫力。

表1 免疫后各组小鼠平均血清抗体效价

2.佐剂对小鼠体重变化的影响:根据表2计算出各时间段小鼠体重增加的平均值，使用SPSS V 12.0进行方差分析以确认红豆杉佐剂的疫苗和纳米乳包裹红豆杉佐剂的疫苗对小鼠机体的刺激性。统计结果显示，差异显著性水平P=0.992，表明5组小鼠体重增长并无显著差异。证明以红豆杉为佐剂的疫苗和以纳米乳包裹红豆杉为佐剂的疫苗对小鼠机体刺激性较小，对其生长并无显著影响。

表2 各组小鼠不同时间平均体重(g)

3.两种佐剂的LD50测试结果:实验数据见表3和表4。以SAS v12.0统计软件分析得到红豆杉提取物的LD50为295.43285mg/kg，95%可信区间为257.07704～336.95574mg/kg，并得到以死亡概率单位为应变量，以对数剂量为自变量建立的直线回归方程为: Y=－15.6625+6.3399X，对该方程的拟合优度Chi－square检验结果显示P=0.795，说明拟合度良好。根据急性毒性分级标准，红豆杉提取物属于中等毒级物质［6］。纳米乳包裹红豆杉提取物的 LD50为7.32512g/kg，95%可信范围为6.90906～7.74439g/kg，并得到以死亡概率单位为应变量，以对数剂量为自变量建立的直线回归方程为:Y=－16.8027+ 19.4292X，对该方程的拟合优度Chi－square检验结果显示，P=0.393，说明曲线的拟合度良好。根据急性毒性分级标准，纳米乳包裹红豆杉提取物属于实际无毒级物质［6］。纳米乳的减毒作用可能同其特性有关，一方面，纳米乳粒径小，红豆杉富集于乳滴内后增大了与机体接触的表面积，增强了佐剂活性，减少了红豆杉的剂量，并提高了抗原的靶向投递，降低了红豆杉的毒性不良反应;另一方面，纳米乳的贮存抗原的作用延缓了红豆杉的释放，这样可能使同一时间释放的毒物不足以对机体有害或者减缓的毒物释放过程中机体产生了抗毒机制。

表3 红豆杉提取物LD50实验结果

表4 纳米乳包裹红豆杉提取物的LD50实验结果

讨论

流感是世界公共卫生的重大挑战之一，流感传染性强、流行快、变异迅速，能够引起多种严重的并发症并导致较高的病死率，已对世界公共卫生安全构成了严重威胁。目前防止流感最有效的手段就是接种流感疫苗，但是当流感大规模暴发时，传统的流感疫苗研发和生产的方法无法满足在短时间内提供足够多的疫苗免疫易感人群。因此，研发能够预防和及时应对大流行流感的疫苗对我国公共卫生具有十分重要的意义［7］。

佐剂是一种抗原辅助剂，与疫苗共同使用可以明显提高疫苗的免疫效果［8］。若辅以较好的佐剂，即可在增强流感疫苗免疫效果的同时，减少每剂流感疫苗的使用量，让更多的易感人群能够接种疫苗，达到迅速应对大流行暴发的目的。

我国在中草药研究方面具有很大的优势。充分发挥我国在中草药方面的优势，从天然中草药中筛选出流感病毒疫苗佐剂具有较强的可行性及重要性。现有的研究成果表明很多中草药对人体的特异性免疫和非特异性免疫均有不同程度的调节作用，其中多种中草药提取物具有较好的佐剂效果［9～12］。

纳米乳剂作为疫苗佐剂的研究也是近年来的一个热点。大量的研究证明，纳米乳佐剂对于主药(包括多种天然药物)成分具有良好的增溶作用，并能促进其吸收，提高生物利用度以及减少过敏反应等。Paul等关于纳米乳在乙肝疫苗临床中应用的报道和Anna等关于纳米乳是艾滋病毒疫苗黏膜给药的有效佐剂的研究，都表明纳米乳能有效增强Th1诱导的细胞免疫［13，14］;Hamouda等［15］研究证实纳米乳剂可以有效提高血凝素抗原的流感免疫原性。

本研究首次选取了具有抗癌效果的红豆杉和纳米乳包裹的红豆杉进行动物实验来检测二者对流感疫苗的佐剂效果。结果表明，本次实验中的红豆杉提取物和纳米乳包裹红豆杉提取物均具有良好的佐剂效果，有效地提高了HI抗体效价，可以减少抗原用量并增强免疫效果，而纳米乳包裹的红豆杉可以增强红豆杉的佐剂活性，更大程度提高了抗原等的靶向投递，其产生的免疫增强作用整体优于铝佐剂。LD50的检测数据表明二者作为佐剂应用于小鼠，对小鼠的生长状况没有明显的影响，可以作为安全有效的新型疫苗佐剂候选，并为相关的药物开发和临床应用提供了毒性依据，同时也明确表明了纳米乳可以有效的降低红豆杉的不良反应。关于红豆杉的免疫增强机制和对不同疫苗的佐剂效果以及纳米乳的免疫增强机制和减毒机制仍需进一步研究，而中草药和纳米乳结合作为联合佐剂是一个崭新而有前景的研究方向。

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