Rh IL－21对NK－92M I细胞生物学活性的影响

郑 瑞 陈葆国 颜卫华 李伯利 章卫国 干灵红

IL－21主要是由活化的CD4+T细胞和NKT细胞分泌，属于γc(共同γ链)细胞因子家族成员之一［1～3］。至今有不少关于白介素(IL)－21对鼠和人NK细胞生物学调节的研究。曾发现IL－21和IL－15体外共同培养的鼠NK细胞，其增殖受到抑制，IL－21也并非NK细胞早期成熟必须的细胞因子［4］。IL－21可以通过增强鼠NK细胞杀伤活性对NKG2D配体阳性的肿瘤细胞有抑制作用，但也有研究表明IL－21通过下调人primary NK和CD8+T细胞表面NKG2D/DAP10的表达，而抑制primary NK细胞通过NKG2D介导的细胞毒作用［5，6］。可见IL－21对NK细胞功能的调节可能因种群差异存在差异。因此本文通过rhIL－21对NK－92MI细胞生物学活性调节的研究，进一步探讨IL－21对NK细胞的免疫调节作用。

材料与方法

1.材料:rhIL－21及Human IFN－γMini ELISA Development Kit购自美国PeproTech公司，细胞毒活性检测试剂盒CytoTox 96®Non－Radioactive Cytotoxicity Assay购自美国Promega公司，PE标记鼠anti－hNKG2D购自R＆D公司，TRizol Reagent购自美国Invitrogen公司，Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自加拿大Fermentas(MBI)公司，凋亡检测试剂盒购自联科生物 AnnexinV/PI apoptosis kit，胎牛血清、新生牛血清、马血清、RPMI－1640及α－MEM基础培养基均购自美国GIBCO公司。引物由上海基康是生物技术有限公司合成。NK－92MI细胞(恶性非霍奇金淋巴瘤患者外周血NK细胞系NK－92经稳定转染hIL－2后得到)及K－562细胞(人慢性髓系白血病细胞系)均为本室保存。

2.细胞培养:NK－92MI细胞培养:在α－MEM培养基中加入终浓度为12.5%的胎牛血清和12.5%的马血清，于37℃、含5%CO2和95%湿度的孵箱常规培养;K－562细胞培养:于RPMI－1640培养基中加入10%的新生牛血清，常规传代培养。

3.细胞增殖试验:取处于对数生长状态良好的NK－92 MI细胞，1200r/min×4min，离心。PBS洗1次，1m lα－MEM完全培养基悬起细胞，计数。调整细胞浓度为1×105/ml，备用。按rhIL－21药物浓度实验分4组，分别为0ng/ml，25ng/ ml，50ng/ml和100ng/ml组。配备含200ng/m l rhIL－21的α－MEM完全培养基1ml(取2μl100ng/μl的rhIL－21加入到1mlα－MEM完全培养基)于96孔板实验各孔加入100μl的α－MEM完全培养基，取含200ng/ml rhIL－21的α－MEM完全培养基加入到第一组各孔，100微升/孔。轻混匀后分别取100微升/孔加入下一个稀释度的各孔依次倍比2稀释，3复孔/稀释度，取NK92 MI细胞悬液100μl加入各相应孔。将96孔板置37℃、5%CO2孵箱中培养，分别在24、48和72h 3个药物培养时间段收集细胞并计数。

4.细胞毒效应试验:取生长状态良好NK－92MI细胞，PBS洗涤两次后，于100ml培养瓶中按2×105个/ml细胞浓度培养，一组加入终浓度为50ng/ml rhIL－21，一组未加药物，在37℃、含5%CO2的孵箱常规培养48h。收集预处理后细胞，PBS洗涤3次，把两组细胞浓度调为4×106个/毫升备用。取U型底96孔板，按CytoTox 96®Non－Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒操作步骤，设靶细胞自然释放孔、培养基背景孔、靶细胞最大释放孔、体积校正孔及效应细胞自然释放孔。取准备好的NK－92MI细胞加入96孔板，以倍比稀释法设立6个效应细胞浓度梯度，体积50微升/孔。再取准备好的生长状态良好的靶细胞K－562(2×105个/毫升)50μl加入到相应各孔，使效靶比分别为20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1、1.25∶1共5个浓度梯度，每个梯度4个复孔。在37℃、含5%CO2的孵箱常规培养4h后，以每孔10μl裂解液加入到靶细胞最大释放孔和体积校正孔，再孵育45min后，取出250g×4min离心，收集上清50微升/孔，移入另一平底96孔板，再加入反应液50微升/孔，避光室温孵育30min，490nm读取吸光度值。通过检测上清中LDH含量计算NK－92MI对K－562细胞的细胞毒活性。细胞毒效应计算公式:细胞毒(%)=(实验组－效应细胞自发释放－靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放－靶细胞自发释放)×100%。

5.流式细胞术(FACS)检测:以50ng/m l rhIL－21预处理NK－92MI细胞48h，同时设PBS对照组(即未加药组)。收集细胞用PBS洗涤两次，离心后，用300μl PBS重悬细胞混匀，平分为3管，一管加入anti－IgG－PE/IgG－FITC同型对照荧光标记抗体，一管加入anti－Granzyme B－PE荧光标记抗体，另一管加入anti－hNKG2D－PE荧光抗体，室温孵育30min，PBS洗涤两次，细胞用500μl PBS悬起，上机分析。同样方法培养细胞48h和72h，按AnnexinV/PIapoptosis kit操作步骤检测rhIL－21对NK－92MI细胞凋亡影响。

6.RT－PCR检测目的基因的表达:分时收集50ng/ml预处理0、6、12和24h的NK－92MI细胞，PBS洗涤2两次，细胞计数板计数，每次取同等量细胞，用TRizol试剂盒抽取细胞总mRNA。反转录反应取2μl mRNA，总体系为20μl，合成cDNA。PCR反应体系为25μl:2.5μl 10×Buffer，1.5μl 25mmol/L MgCl2，0.5μl dNTP，0.5μl cDNA，各0.5μl上下游引物，0.5μl Taq DNA聚合酶，18.5μl去离子水。反应条件:94℃10min; 94℃1min、56℃45s、72℃45s共38个循环;72℃min;4℃ Hold。取4μl PCR产物用1.3%琼脂糖凝胶电泳分析，结果用Quantity one软件进行灰度分析，对目的基因进行半定量。各引物如表1。

表1 各PCR引物序列及扩增片段长度

7.ELISA 检测IFN－γ的分泌:试验于96孔板中进行，检测50ng/m l rhIL－21药物在不同时间对NK－92MI细胞分泌IFN－γ的影响。体积为200微升/孔，每个时间梯度(12h，24h和48h)3个复孔，同时设培养基(含12.5%胎牛血清和12.5%马血清的α－MEM)和常规NK－92MI细胞培养对照组，于37℃、含5%CO2的孵箱培养。按 Human IFN－γMini ELISA Development Kit实验步骤进行，检测490nm吸光度值。

8.统计学方法:所有数据均采用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料描述用均数±标准差±s)表示，统计分析前各组数据均进行方差齐性检验，多组间数据比较采用One－way ANOVA方差分析，组间两两比较采用LSD统计方法，两组间比较采用两组间独立样本t检验(细胞杀伤实验采用配对资料t检验)，P＜0.05为差异具有显著性。

结果

1.RhIL－21对NK－92MI细胞增殖的影响:实验数据显示，随培养时间的延长实验组及对照组细胞均有不同程度的增殖(One－way ANOVA方差分析，结果显示各组P均＜0.05)。同时观察到随培养时间的延长各组之间细胞的增殖并不同步，实验组较对照组细胞生长缓慢，特别是在培养72h之后，差异更为显著(P=0.000)，可见rhIL－21抑制了NK－92MI细胞的正常增殖，但并未看到呈药物浓度梯度依赖性抑制，统计学显示各实验组之间差别无统计学意义(P＜0.05)。结果如表2所示。

表2 不同浓度rh IL－21对NK－92M I增殖的影响

2.rhIL－21对NK－92MI细胞凋亡的影响:鉴于结果1所示，不同剂量rhIL－21对NK－92MI细胞的增殖有不同程度的抑制，我们选择既能发挥药效又不至于过度抑制细胞生长的剂量(50ng/ml)进行后续试验研究。在50ng/ml rhIL－21培养NK－92MI 48h和72h后，Anexin V和PI染色显示，实验组和对照组细胞凋亡率的差别无统计学意义(48h，P=0.947; 72h，P=0.325)，且不随培养时间的延长而增加，即50ng/ml rhIL－21并未增加NK－92MI细胞的凋亡。结果如表3所示。

表3 rh IL－21对NK－92M I凋亡的影响(%)

3.rhIL－21对NK－92MI细胞细胞毒效应的影响:以50ng/ml浓度的rhIL－21预处理NK－92MI 48h后，观察NK－92MI细胞毒效应的改变。结果显示在效靶比为5∶1、2.5∶1、1.25∶1时，50ng/ml能增强NK－92MI细胞的细胞毒活性(P＜0.05)。结果如图1所示。

图1 rh IL－21对NK－92M I细胞毒效应的影响

4.rhIL－21对NK－92MI细胞相关基因表达的影响:RT－PCR结果显示，50ng/ml rhIL－21能够促进NK细胞细胞毒效应相关基因如颗粒酶－B (274bp)、穿孔素(511bp)、IFN－γ(339bp)以及NK细胞表面活化型受体NKG2D基因(416bp)mRNA的表达，且均呈时间依赖性表达增强(P＜0.05)，见图2，用Quantity one软件分析目的基因与β－actin的灰度比值见表4。

图2 RT－PCR鉴定NK－92M I细胞活化相关基因表达

5.rhIL－21对NK－92MI细胞表面NKG2D受体及胞质颗粒酶－B蛋白的调节:50ng/m l rh IL－21处理NK－92MI细胞48h后，细胞表面NKG2D受体的平均荧光强度及胞质颗粒酶－B蛋白的表达均明显增强(NKG2D，P=0.00;颗粒酶－B，P=0.00)，如图3及表5所示。

表4 不同时间目的基因的表达量变化

图3 流式细胞术检测NK－92M I细胞表面NKG2D受体及胞内颗粒酶－B的表达

表5 NKG2D及颗粒酶－B蛋白平均荧光强度的变化

6.rhIL－21对NK－92MI细胞IFN－γ分泌的影响:根据 ELISA标准曲线公式(y=755.81x2－721.46x+139.66，r2=0.9551)计算相应吸光度值对应的IFN－γ浓度。随培养时间的延长，两组细胞分泌IFN－γ水平均有升高(实验组P=0.000，对照组P=0.000)。但与对照组比较，50ng/ml rhIL－21药物处理组细胞分泌IFN－γ的能力在24h和48h时，均明显高于对照组(24h P=0.020，48h P=0.002);而在12h时两组相比，分泌IFN－γ水平无显著性差异(P=0.173)，如图4所示。

图4 50ng/m l rh IL－21对IFN－γ分泌的影响

讨论

自Parrish－Novak等［1］报道IL－21对NK细胞的研究以来，有较多关于IL－21对人及鼠NK细胞增殖、免疫调节及抗肿瘤效应等各方面的研究。针对IL－21对NK细胞增殖的研究，有报道表明IL－21能抑制IL－15或IL－2活化的鼠NK细胞的增殖，并能促使NK细胞通过经典的凋亡途径发生凋亡［4，7］。虽然种属不同，但与本研究rhIL－21能不同程度抑制NK－92MI细胞增殖的结果相近。然而这种生长抑制不是NK－92MI细胞凋亡率增加的结果，本研究并未发现rhIL－21培养组和对照组在NK－92MI生长48h后，Annexin V+/PI+双阳性细胞百分率的差异。这同Skak等［8］报道的，IL－21能促进人外周血纯化的NK细胞的存活率结果相吻合，或者至少证明了IL－21不会促进人NK细胞的凋亡。

作为具有天然抗肿瘤活性的NK细胞，其细胞毒效应可受多种细胞因子的调节。研究IL－21对NK细胞细胞毒效应的影响，是IL－21对NK细胞各种免疫调节的综合体现。本研究结果表明50ng/ml浓度的rhIL－21均能显著增强NK－92MI细胞对靶细胞K－562的细胞毒效应，这与Skak等［8］的研究结果一致，尽管也有其他研究结果与此不同，但多数研究支持 IL－21能增强 NK细胞细胞毒效应的结论［5～8］。传统理论认为NK细胞的活化是细胞表面活化型受体和抑制型受体综合作用的结果，因此本实验分别从基因和蛋白质水平上检测了rhIl－21对NK－92MI细胞表面主要活化型受体NKG2D的调节。结果表明，50ng/ml的rhIl－21能逐渐增强NKG2D基因mRNA的表达，并能显著增强培养48h后NK－92MI细胞表面NKG2D受体的平均荧光强度。Skak等［8］报道IL－21能增强外周血单个核细胞中NK细胞表面细胞毒效应受体NKp46、活化型受体NKG2D及抑制型受体CD94和NKG2A不同程度的表达上调，而最终表现为细胞毒活性的增强。而 Burgess等［6］曾报道IL－21通过下调纯化人primary NK细胞表面NKG2D/DAP10的表达，而抑制primary NK细胞通过NKG2D和其配体介导的细胞毒活性。这种结果的差异是否由不同细胞系造成?有待于体内实验或更多实验进一步验证。

RT－PCR结果显示IFN－γ、穿孔素及颗粒酶的表达随rhIL－21培养时间的延长而逐渐增强，且IFN－γ的分泌及颗粒酶蛋白表达水平也明显增强。这进一步验证了NK－92MI被rhIL－21活化后细胞毒效应的增强机制。IFN－γ是在细胞免疫中发挥关键调节作用的细胞因子，显然rhIL－21促进NK－92MI细胞分泌的IFN－γ，进一步增强了细胞免疫能力。这有利于在肿瘤免疫中机体抗肿瘤免疫的能力，但也可能导致机体过度免疫而产生自身免疫性疾病。当然机体的免疫平衡的维持靠复杂的细胞因子网络的调节。曾有研究表明高浓度的IFN－γ能下调人NK细胞活化型受体NKG2D基因及蛋白水平的表达，IL－21可以通过对转录因子Eomesodermin的抑制而下调CD4+T细胞分泌IFN－γ能力。

通过本实验的研究，进一步认识了IL－21对人NK细胞免疫调节作用，然而对单纯的体外实验和细胞系研究并不能模拟人体复杂的微环境，实验结果不能完全揭示疾病状态下IL－21对NK细胞的调节。因此通过对自身免疫性疾病或肿瘤患者机体免疫状态的检测、细胞因子的分析及精细的体内实验的研究，观察IL－21在相关疾病中所扮演的角色，将对全面认识IL－21生物学活性非常重要。

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