共振瑞利散射光谱法同时测定手性对映体的研究进展

杨季冬杨 琼周 尚

（1.重庆三峡学院化学与环境工程学院，重庆万州 404100）

（2.长江师范学院化学化工学院，重庆涪陵 408100）

共振瑞利散射光谱法同时测定手性对映体的研究进展

杨季冬1,2杨 琼2周 尚2

（1.重庆三峡学院化学与环境工程学院，重庆万州 404100）

（2.长江师范学院化学化工学院，重庆涪陵 408100）

自然界广泛存在具有手性的有机对映异构体，还有很多人工合成的手性化合物．这些手性化合物的物理化学性能相似相近，但其旋光性、生物活性和环境行为迥然各异．对这些有机对映体的手性识别和分离分析则是分析化学中很有吸引力的课题．人类对手性化合物的认识和手性识别经历了感性和理性的飞跃，尤其是对其手性识别从操作到理论分析，产生了许多手段和方法．但是适应不同要求的分离分析仍然在快速发展，尤其是不经分离而同时测定手性对映体的方法还在不断探索中．笔者拟用高灵敏度的共振瑞利散射光谱法为主的分子光谱分析方法进行深入研究，拟建立一种快速简捷高效的同时测定手性对映体的现代分析方法．

手性对映体；手性识别；同时测定；共振瑞利散射光谱法

1 引 言

有机对映异构体在自然界广泛存在，包括人工合成的众多手性化合物．对这些有机对映体的手性识别和分析，尤其是不经分离就同时测定是分析化学的前沿性研究课题．目前外消旋手性对映体的医药和农药的生产和使用已相当普及，无论是天然提取或人工合成的，在全球市场销售与临床使用的约有50%属于外消旋手性对映体药物（chiral enantiomer drugs），[1]（35）手性对映体农药（chiral enantiomer pesticides）也占40%以上．这些共存的手性对映异构体药物，其生物活性具有显著差别，对其药理药效则产生显著的影响；手性对映体农药不仅对靶标的生物活性表现出显著差异，而且对非靶标的环境行为迥然不同．[2]因此对外消旋手性对映体药物的分离分析和测定一直受到分析化学家的关注，这方面的研究工作虽已取得很大的进展，但仍有许多值得深究和可观的发展前景．[3]手性对映体（chiral enantiomer）是自然界存在的普遍现象，组成蛋白质的天然氨基酸都是L-构型，而天然的糖类则大多数为D-构型，DNA的螺旋构型都是右旋，人们也发现海螺的螺纹是右旋的，缠绕植物也是右旋居多．在它们的作用过程中具有很强的立体专一性，有很强的镜像对称规律．如人工合成的D-构型氨基酸会有什么样的性质和生理活性？由这样的氨基酸组成的多肽和蛋白质有什么样的生理作用？人工合成的L-构型的糖类又会有什么不同的性能？左旋肉碱的减肥作用很受女士们的青睐，而右旋肉碱又有些什么不同的作用呢？所有这些问题的探索和进展，无疑将为分子水平上揭开生命中的种种奥秘铺筑道路．而对于无论天然的或人工合成的手性药物，大量人工合成的手性农药，均存在相当部分的外消旋对映体，这些对映异构体的性能和药理药效的差异已逐渐为人们所认识．如何检测外消旋对映体的存在或检测手性对映体药物及农药的光学纯度，尤其是不经分离而同时测定手性对映体药物或农药，则对生产质控、用药安全和进一步的药理研究具有更重要的意义．

手性是物质的一种自然属性．所有物质均可分为手性的和非手性的两大类：一个物体，如果不能与其镜像叠合，即实物和其镜像不同，则称其具有手性；相反，一个物体，其实物与镜像可以重叠，则称其为非手性的．许多物质是具有手性的，人类的手即具有典型的手性，无论左手或右手放到镜子前出现的镜象总是相对的右手或左手，这左手和右手呈镜象对称却不能重叠．在生活中人们发现海螺的螺纹和缠绕植物的旋转方向都是手性的，后来的科学发现蛋白质、多糖、DNA和酶这些组成生命的基石——生物大分子都是具有手性的．从分子水平上讲，手性都源自于手性分子．一个碳原子如结合四个不同的原子或基团，称为不对称碳原子，含有不对称碳原子的分子就有可能具有手性；具有一个不对称碳原子的分子，存在一个镜象的分子，两者呈镜象对称不叠合，互称为手性对映体．手性对映体的物理化学性质都极其相似，唯有不同的是旋光作用不同，其中一个旋光若是左旋的，而另一个则必然是右旋的．前面讲的手性物质都是具有不同的旋光性的，地球上人类的DNA都是右旋光的，人们试曾设想在外星球是否存在其DNA为左旋的灵智似人类的动物呢？作为含有多个不对称碳原子的有机分子中，若其不对称碳原子为偶数个，则其旋光性可能在分子内相互抵消，这就是内消旋分子；若其不对称碳原子为奇数个，则势必存在另一个旋光相反的对映体，此为外消旋对映体，即如这样的对映体等量存在同一体系中，则总体反映无旋光．对外消旋对映体的手性识别一直是研究的热点，目前人为的手性拆分的研发手段和方法很多，也很有成效，然而人为的手性识别却是很困难的，如不须分离而同时测量和表征手性对映体，或者测定某一手性物质的光学纯度是相当不易的．然而在自然界对手性对映体的识别是很容易的，因为自然机体中的生物大分子本身的手性对手性对映体的区分符合其自然法则．

2 手性对映体的研究意义

有机对映体呈镜像对称，其物理化学性能都相似相近，但却有不同的生物活性．手性对映体药物常常具有不同的药效和毒副作用，其中之一对映体不仅缺乏药效而且有很强的毒性和副作用．这是由于生物体系内部的受体如酶、核酸、蛋白质和多糖等生物大分子具有与其功能相适应的手性结构，不同对映体药物进入生物体后，其生物化学反应、药理作用和代谢途径可能不同，其生物活性、药效和毒副作用就会各不相同．例如镇静剂Thakidomide（反应停），其有效成分是（R）型，具有良好的镇静作用，而它的（S）型则具有胚胎毒性和致畸作用；Verapamil（异搏停）的（S）型与（R）型在人体内的代谢速率具有显著的立体选择性差异．目前常用药物中约占一半以上为外消旋对映体，即为两种光学异构体的等量混合物，其中一种为有药效的优势对映体，另一种则为劣势对映体．[4]为了用药的安全有效，有必要对手性药物的各个异构体分别进行考察，了解各自的生物活性．美国（FDA）及许多发达国家的药政管理组织已明确规定，[5]要求申报手性药物时，必须对不同异构体的生理作用和毒理学数据以及各占比例提供清楚的报告．手性农药的对映异构体具有不同的生物活性（杀虫、除草、杀菌活性等），同时对映异构体间还存在毒性、降解或代谢及残留等不同的环境行为．常见三类手性农药是拟除虫菊酯杀虫剂，苯氧丙酸类除草剂和唑类杀菌剂，它们其中的单个异构体具有较强的生物活性．如广泛使用的除草剂异丙甲草胺（metolachlor），其S-构型的对映体对靶标杂草的活性比R-构型的对映体高10倍以上；杀菌剂甲霜灵（metalaxyl）的杀菌活性则都是来源于R-构型的对映体．同时，手性农药对非靶标环境的作用亦体现出显著差异．如1S-联苯菊酯（1S-cis-bifenthrin）的内分泌干扰的效应远高于1R-联苯菊酯，而1R-联苯菊酯对靶标生物的活性则显著高于1S-联苯菊酯，这表明1R-联苯菊酯是一个安全高效的构型．因此手性药物或农药的分离分析及其分别测定在分析测定任务中就占有很重要的地位，然而由于手性对映体的物理化学性质几乎完全相同，利用常规的分离分析手段无法实现对它们的分离，未经分离而同时测定则更是无能为力，因此分析化学界和药学界一直致力于探索分离分析手性对映体药物的新原理和新方法．

目前常用的分离分析手性对映体的技术手段是色谱法和毛细管电泳法，[6,7]以及利用扫描探针技术（STM）和原子力显微技术（AFM）实现手性分子的识别．[8]一般采用直接和间接两种途径，均为先分离后分析．直接法系采用手性固定相和手性流动相添加剂两种操作：手性固定相法是基于样品与键合到载体表面的手性选择剂间结合，形成暂时的非对映络合物，按其能量差或稳定性不同从而达到手性分离；手性流动相添加剂法则是通过对映体与添加到流动相中的手性分子形成一对非对映的络合物，由于非对映络合物的稳定性、在流动相中溶剂化作用或络合物与固定相的键合等性质的差异而得到分离．间接法是将手性对映体混合物与光学纯的手性试剂反应，生成两个非对映异构体，然后用常规的色谱方法分离，对分离出的衍生产物进行分析测定，或再经还原分别得到原来的对映异构体后测定．这两种方法均不简便且增大分析成本．

3 手性对映体同时测定的意义

如果要在特定情况下实现对生产流程的质控检测中简捷快速得出结果，对某些手性对映体药物进行快速简便的痕量分析，则以不经分离而同时测定左、右旋两种异构体为最理想．目前进行这方面研究工作的报道还很少见，而依托超分子体系的识别能力和光、电信号传递功能对手性对映体进行拆分和分别测定已有报道，其中大都采用冠醚、环糊精、大环多胺、环番、穴芳烷、杯[n]芳烃、卟啉等大环超分子体系作为手性选择试剂，还有以联萘、多环芳烃、蛋白质及酶、Cu(II)络合物等具有光学活性基团且与手性对映体作用的手性光学探针．[9]如文献[10]研究发现D、L-色氨酸对映体在β-环糊精存在下呈现显著不同的手性包络差异，这种差异与酸度和温度密切相关；可实现色氨酸对映体的手性识别荧光同时测定．文献[11]报道在BAS体系中以芘为微环境光学探针，并以时间分辨荧光探针技术实现了不经分离识别D、L-色氨酸对映体并同时测定．这两项研究一是利用超分子体系的手性识别能力，即在形成不同的环糊精包合物的选择性以及其增溶、增敏作用加强了光学差异；二是在蛋白质手性体系中与手性的微环境光学探针作用产生强荧光，再分别与左、右旋的色氨酸作用后导致不同程度的荧光猝灭，反映出一定的荧光寿命差异，因而反映在光谱上有可检测的差异信号．但用荧光法识别手性药物本身或者反应产物必须具有荧光，这在一定程度上限制了方法的应用范围．

而直接利用共振瑞利散射（RRS）分析和非线性共振散射（RNLS）分析方法进行手性对映体的同时测定尚未见文献报道．RRS和RNLS光谱分析是近年发展起来的新分析技术，由于RRS兼具散射和电子吸收光谱的双重特性，它既与分子中电子在入射光电磁场作用下发生受迫振动有关，又受电子能级跃迁的影响，因此形成了一种新的光谱特征，因而它能够对研究分子结构和形态、电荷分布、键合性质以及反应特征等提供更丰富的信息．特别是它对生物大分子之间或生物大分子与小分子之间的非键作用，如缔合、聚集、偶极－偶极作用、疏水作用、长距离组装等作用十分敏锐，从而成为某些生物大分子的表征和测定及反应历程研究的一种非常有用的技术．RNLS是由共振瑞利散射引起的一种共振非线性散射，研究发现在入射光波长的1/2倍和2倍处也能产生强烈的倍频散射（Frequency-doubling Sacattering，FDS）和二级散射（Second Order Scattering，SOS）．由于这些散射的波长位置、强度变化等特征与一般的非线性光学现象一致，且与RRS存在相关性，伴随着RRS的产生和强弱变化而同步变化，彼此之间存在强烈的依存关系．[12](280)随着RRS分析技术的应用研究日益扩展，此技术在核酸、蛋白质、多糖等生物大分子[13]分析离子缔合物测定痕量物质，[14]有机化合物和药物分析方面也有更多的研究和应用，[15]还在纳米微粒的研究中也得到新的应用．[16]最近我们的研究表明某些有机化合物的异构体或同系物、某些手性对映体药物及其反应产物能表现出不同的RRS和RNLS光谱特征和不同的强度变化，例如用共振瑞利散射光谱法测定β-环糊精与盐酸普鲁士卡因和β-环糊精与氯霉素的包结常数；[17]又如用RRS同时测定两种吩噻嗪药物（CPZ和PZ）；[18]还有利用色氨酸的手性D、L-对映体，[19]萘酚的α-和β-异构体[20]等产生不同的共振瑞利散射光谱特征，从而对两种异构体进行识别和同时测定．表明了RRS和RNLS识别不同的手性异构体的可行性和潜在的应用价值．与荧光法识别手性药物相比，RRS光谱法不受药物或农药及其反应产物必须具有荧光的限制．由于多数药物本身并无荧光，因此RRS可能具有更广泛的应用范围．然而迄今RRS和RNLS技术在药物或农药手性识别的研究方面刚刚起步，虽已取得初步的研究成果，但尚应进一步深入研究．可以预料，这是一个极有应用前景和开发价值的新的研究领域．

4 手性对映体同时测定的发展

综上所述，利用RRS和RNLS光谱分析技术，探索有机对映异构体手性识别的新原理．

1）通过试验大环或笼状化合物（冠醚、环糊精、大环多胺、环番、穴芳烷、杯[n]芳烃、卟啉等）与外消旋的氨基酸类、含苯环的羧酸类、酯类、磺酸类等小分子类的手性对映体药物或农药形成超分子体系的反应，以筛选出合适的超分子体系的手性选择性试剂．

2）通过试验具有光学活性基团的手性光散射探针试剂（联萘及其衍生物、多环芳烃、大分子抗生素、蛋白质及酶等生物大分子、Cu(II)等金属络合物）与外消旋的烯烃类、多环芳香烃类，以及含硫、含磷化合物等大分子类手性对映体药物或农药相互作用形成非对映异构体的复合物，以筛选出合适的手性微环境光散射探针试剂．

通过研究手性药物或农药形成手性超分子体系或非对映体复合物体系的反应机理和过程，探索RRS和RNLS光谱特征、稳定环境和控制条件，发展手性对映体手性识别的新技术．针对不同的手性药物或农药反应体系的RRS和RNLS光谱的特征变化和信号差异，同时结合紫外光谱、圆二色谱、时间分辨和偏振荧光、红外光谱等多种分子光谱方法的验证，充分利用多元回归图解法、主因子分析法、偏最小二乘法、小波分析法以及“同原射线计量分析”[19-20]等化学计量学的辅助，建立同时测定外消旋手性对映体药物或农药的新方法，实现对外消旋手性对映体药物或农药不经分离的同时测定，实现手性农药的质量控制与分析，建立多种常用手性农药光学异构体纯度，或确定其对映异构体在环境中的比率的分析方法．不仅扩展和深化共振光散射技术的新分析应用，而且拓展了手性药物或农药的手性拆分和手性识别的新途径．因此这是一项有重要意义的前沿性研究课题，这不仅是分析化学学科发展的需要，也是适应社会发展的需要．

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（责任编辑：张新玲）

Abstract:Chiral organic enantiomers and synthetic chiral compounds exist widely in nature. The physical and chemical properties of these chiral compounds are very similar, but the optical activity, bioactivity and environmental action are dramatically different. The chiral recognition and separation and analysis of these organic enantiomers are a very attractive topic in the analytical chemistry field. The identification and recognition of the chiral compounds have experienced the perceptual and the rational leap, especially in the operation and theoretical analysis of chiral compounds’ recognition, many means and methods were developed. The separation and analysis for adapting to the different requirements are still in rapid development; especially the methods of simultaneously determined chiral enantiomers without the separation are still in continuous exploration. The high sensitivity method of molecular spectral analysis of resonance Rayleigh scattering spectra will be adopted in our future research, and a simple and efficient and rapid determination of chiral enantiomers modern analysis method will be established.

Keywords:chiral enantiomers; chiral recognition; simultaneous determination; resonance rayleigh scattering spectral method

Research Progress on Simultaneous Determination of Chiral Enantiomers by Resonance Rayleigh Scattering Spectral method

YANG Ji-dong1,2YANG Qiong1ZHOU Shang1
(1. School of Chemistry and Environmental Engineering, Chongqing Three Gorges University, Wanzhou, Chongqing, 404100; 2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Yangtze Normal University, Fuling, Chongqing, 408100)

O657.3

A

1009-8135（2012）03-0090-05

2012-03-20

杨季冬（1956-），男，重庆丰都人，教授，博士，博士生导师，主要从事分子光谱分析研究.

本文系国家自然科学基金项目（No.21175015）研究成果之一