白耙齿菌发酵物多糖及蛋白的含量测定

2012-04-01袁文彬王淑敏翁丽丽

长春中医药大学学报 2012年3期

关键词：试液总糖定容

袁文彬，王淑敏，陈新，翁丽丽*

(1.长春中医药大学，吉林长春 130117；2.吉林省消防总队医院，吉林长春 130061)

白耙齿菌(IrpexlacteusFr.)为齿菌科耙齿菌属的一种药用真菌，别名白囊孔。其子实体生于阔叶树的枯立木、枯枝上。主要分布于吉林省长白山区、河北、山西、陕西、河南、甘肃、安徽和浙江等省区[1]。其发酵物用于治疗肾小球肾炎。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 SPD-10Avp紫外分光光度计。

1.2 试剂白耙齿菌发酵物由长春中医药大学真菌研究室提供。葡萄糖标准品由中国药品生物制品检定所提供；牛血清蛋白购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。3,5-二硝基水杨酸试剂、考马斯亮蓝G-250等。

2 方法与结果

2.1 多糖的含量测定[2-3]

2.1.1 对照品溶液的制备取于105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品约10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备称取本品粉末约1 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水50 mL使溶解，水浴保温30 min，定容至刻度。过滤，供配制总糖供试液和还原糖供试液。

总糖供试液的制备：精密量取供试品溶液制备项下续滤液2 mL，置25 mL容量瓶中，加6 N盐酸8 mL，置沸水浴加热30 min，冷却后加1滴酚酞指示剂，用40%氢氧化钠溶液中和至微红色,加水定容至刻度，摇匀即得。

还原糖供试液制备：精密量取供试品溶液制备项下续滤液2 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀即得。

2.1.3 测定法精密量取总糖及还原糖供试品溶液各1 mL，分别置25 mL容量瓶中，分别加入1 mL水及1.5 mL 3、5-二硝基水杨酸试剂，按标准曲线法测定吸收度，计算总糖及还原糖的量，以总糖的量减去还原糖的量即为多糖的量。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 线性关系考察标准曲线的制备：精密量取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分别置于25 mL容量瓶中，补水至2.0 mL，分别加入3、5-二硝基水杨酸试液1.5 mL，混匀，沸水浴5 min，取出，立即冷却至室温，加水定容至刻度，摇匀，依照分光光度法，在532 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，以吸收度为纵坐标，以取样量为横坐标(mg)，得回归方程：Y=0.559 4X-0.043 4r=0.999 6，线性范围在0.200 4～1.402 8 mg。

2.1.4.2 精密度实验取总糖供试液，照测定法重复测定吸光度6次，结果分别为0.471、0.471、0.471、0.471、0.471、0.472，=0.471，RSD=0.087%。结果表明仪器具有良好的精密度。

2.1.4.4 重现性实验按以上方法制备供试品溶液，重复6次，依法测定多糖含量，结果分别为8.07、8.04、8.10、8.06、8.11、8.09，=8.08，RSD=0.330%。表明该方法测定多糖含量重现性好。

2.1.4.5 回收率实验采用加标回收率实验，依法测定总糖供试液吸收度，计算回收率，结果本方法葡萄糖的平均回收率为102.2%，RSD=1.920%，说明该方法测定多糖含量稳定可靠。

2.1.4.6 样品含量测定样品依法平行测定2次，结果分别为8.54%，8.32%，平均值8.43%。

2.2 蛋白的含量测定[4]

2.2.1 标准蛋白溶液的配制取20 mg牛血清蛋白，精密称定，置10 mL的容量瓶中，用0.9%的NaCl溶液定容至刻度。

2.2.2 样品溶液的制备取样品约0.8 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，用0.9% NaCl溶液定容至刻度。

2.2.3 测定法移取样品溶液100 μL于试管中，加入5 mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀后测定其吸光度值，计算含量。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 标准曲线的制定取8支10 mL干净的试管，精密加入标准蛋白溶液0.01、0.03、0.04、0.06、0.07、0.08 mL，分别补充0.9% NaCl溶液至0.1 mL，加入考马斯亮蓝试剂5 mL，混合后在5 min内测定其在595 nm波长下的吸光度值，记录各管测定的吸收度，以吸收度为纵坐标，以取样量为横坐标(mg)，得回归方程：Y=0.003 9X+0.040 8，r=0.999 5，线性范围在20.03～160.21 μg。

2.2.4.2 精密度实验取供试液，照测定法重复测定吸光度6次，结果分别为0.434、0.434、0.434、0.433、0.433、0.433，=0.433 5，RSD(%)=0.126%。结果表明仪器具有良好的精密度。