酶标检测异常结果原因分析及应对

刘自安 徐战锋

酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前血站实验室最常用的免疫学检测方法，由于其试剂稳定，易保存，操作简便，结果判断较为客观［1］，既适宜于大量血液筛查，又可用于少量标本的检测。ELISA试验以其灵敏度较高、特异性较强，重复性较好等特点在临床上得到了广泛的应用，但影响试验检测效果的因素也较多，现就本人在实验操作过程中常见的影响因素进行分析与描述，以提高ELISA检测质量和水平。

1 异常结果描述

1.1 白板

显色步骤结束后，酶标反应板所有孔均无颜色。

1.2 显色弱，灵敏度低

1.2.1 实验结束后，包括阳性对照、室内质控在内的所有板孔颜色均较淡。

1.2.2 实验结束后，阴阳性对照正常，室内质控正常，但血液标本感觉显色较弱。

1.2.3 实验结束后，阴阳性对照正常，但室内质控品或个别弱阳性标本未能检出。

1.2.4 终止完成后，目测结果正常，但酶标仪读值偏低，甚至出现多孔负值。

1.3 灵敏度过高，酶标板本底偏高

1.3.1 终止完成后，整板结果呈现均一的淡黄色或阴阳性对照、质控均正常，但阴性标本OD值过高。

1.3.2 出现随机性的花板及跳孔现象。

1.4 假阳性

假阳性现象是一个综合现象，可参考上述1.3 中的分析与描述。

2 原因分析

2.1 白板

2.1.1 试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用。

2.1.2 错加、漏加试剂组分。

2.1.3 洗板及加样过程中，酶结合物受污染失活而失去催化显色剂显色的能力导致。

2.2 显色弱，灵敏度低

2.2.1 接近或超过有效期的试剂可能会产生很弱的信号。

2.2.2 试剂组分用前未平衡至室温。

2.2.3 加入试剂的量和顺序有误。

2.2.4 洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力导致。或者显色液受到污染。

2.2.5 孵育时间及孵育温度未达到规定要求。

2.2.6 洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求，或者用其他厂家洗液洗板，导致灵敏度偏低。

2.2.7 未达到要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但弱阳性标本受温度变化影响较大而被未检出。

2.2.8 室内质控品高温放置过久或被反复冻融，致使待测物滴度下降，而未能检出。

2.2.9 酶标仪参数设置不正确或滤光片不匹配。

2.3 灵敏度过高，酶标板本底偏高

2.3.1 整板出现“黄板”现象

2.3.1.1 错加其他试剂造成或盛放显色剂容器受到污染。

2.3.1.2 显色剂在光照条件下放置过久，实验前已变蓝。

2.3.1.3 孵育温度过高或孵育时间过长。

2.3.1.4 未按要求洗板，如用自来水冲洗或者非本公司洗液洗板，特别是洗涤时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象。

2.3.2 酶标板呈现“花板”现象

2.3.2.1 血液标本的采集、处理和保存方法不当造成。

2.3.2.2 加样时造成的交叉污染、手工洗板造成的交叉污染、手工拍板时造成的交叉污染以及洗板机某几个加液头堵塞等均可导致“花板”出现。

2.4 假阳性

2.4.1 计算Cutoff 值时使用的公式不正确，导致计算得出的Cutoff值过低，从而导致假阳性出现。

2.4.2 洗板时板孔未能注满洗液或洗板次数、浸泡时间不够，未用试剂盒提供的洗液洗板,导致花板、跳孔，以致假阳性增多。

2.4.3 血液标本处理不当，如标本离心不彻底未完全除去细胞成分、纤维蛋白原及其它干扰物等，可出现孔底由点变蓝的跳孔现象，此标本重复实验结果往往呈阴性反应。

2.4.4 厂家试剂本身的质量变化造成的假阳性。

3 解决方法（对策）

3.1 白板

3.1.1 每次实验前应检查试剂各组分及批号，确认试剂未过期。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。

3.1.2 严格按试剂说明书进行规范操作，错加或漏加试剂组分将会出现白板的异常结果。加完试剂后可目视一下液面高度是否一致，以避免漏加现象。

3.1.3 叠氮钠等酶抑制物会使酶标记物失活，应确认盛酶标的容器不含酶抑制剂，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液用的纯化水达到要求且未受到污染。

3.2 显色弱，灵敏度低

3.2.1 实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。

3.2.2 从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡30min。

3.2.3 确定所使用的每一种试剂加样量准确，且加入顺序适当。

3.2.4 酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用proclin、硫柳汞等其他防腐剂。

3.2.5 孵育温度和时间应满足试剂使用说明书规定的要求。

3.2.6 严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，如浓缩洗液稀释倍数、洗涤次数、浸泡时间等。必须用试剂厂家提供的洗液进行洗板。

3.2.7 标本若需在一周内进行检测的，可暂存于2～8℃，如需长期保存，应置于-20℃以下保存。室内质控品应置于-20℃以下保存，避免反复冻融。

3.2.8 检查仪器是否设定正确，特别是检查滤光片是否匹配。必要时重新设定酶标仪的参数，如有怀疑，可重做实验。

3.3 灵敏度过高，酶标板本底偏高

3.3.1 实验前检查试剂的组分及批号，确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。

3.3.2 避免试剂组分间的交叉污染，确保吸头、容器干燥洁净。

3.3.3 显色剂A和B未使用前应避光保存。

3.3.4 孵育温度和时间应满足试剂说明书规定的要求。

3.3.5 严格按试剂说明书要求洗板。洗涤时每孔均注满洗液，洗涤次数，每次浸泡时间应严格掌握。

3.3.6 待检标本的处理方法:室温下自然放置1~2h再用3000r/min离心15min备用［2］。

3.3.7 加标本时应避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。

3.3.8 手工洗板时第一次注洗液后应立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染。

3.3.9 确保加液头疏通，洗板时每孔均应注满洗液，洗板完毕拍板时应选用合适的吸水纸巾，不可把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍打，以免交叉污染。

3.4 假阳性

3.4.1 Cutoff值计算公式应严格参照试剂说明书设置（不同厂家的Cutoff值计算公式不尽相同）。

3.4.2 严格按说明书要求洗板（不同厂家的试剂洗涤次数、浸泡时间不尽相同）。调整洗板机时，应注意有时仪器标示的液量与实际液量并不相符，应根据实际情况调整至每孔注满。

3.4.3 待检测标本应放置4℃冰箱保存或新鲜标本及时检测［3］。

3.4.4 当国家标准要求提高灵敏度时，厂家试剂的灵敏度也相应提高，假阳率常常有所上升，但只要在合理范围，是可以接受的。

4 讨论

全自动酶免分析仪在血站实验室的普及，极大地促进了酶免疫测定技术的临床应用，实现了ELISA检测的标准化、减轻了实验室技术人员的劳动强度，提高了临床免疫测定的质量和水平［4］。无论怎样先进的仪器都离不开人的操作，再先进仪器也不能解决工作中出现的一切问题，ELISA检测结果的正确与否对血站来说至关重要，一方面，假阳性结果会浪费宝贵的血液资源，另一方面，假阴性结果则不能确保临床用血的安全。因此我们在实际操作中只有正确掌握影响ELISA试验检测效果的各类因素及其解决办法，才能更好地操作仪器，提高血液检测质量，确保临床用血安全。

［1］李楚潮.ELISA,RPR、Trust、TPPA四种方法检测梅毒螺旋体抗体的结果分析［J］.当代医学，2010,16（20）：9-10.

［2］中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范［S］.2004,08:1.

［3］石凌波，崔伟历，张凤川.检验医学分析前质量控制［M］.北京：人民卫生出版社，2009,08:246

［4］李金明主编.临床酶免疫测定技术学［M］.北京：人民军医出版社，2005,05:148