Bcl-2家族研究进展

贾炜

细胞凋亡（apoptosis）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡［1］。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程,是细胞生理性死亡的普遍形式。凋亡过程中DNA发生片段化，细胞皱缩分解成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎症。凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等［2］。

近年来,在细胞凋亡调控中起重要作用的B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukemia-2,Bcl-2)家族蛋白的研究众多,Bcl-2被证实是最重要的有明显抑制细胞凋亡作用的基因。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Mcl-1,Bfel，Al，Ced-9等)和促凋亡蛋白(如Bcl-rambo,Bid，Bax，Bak，Bcl-xS，Bad，Bik等)。多数成员间有两个结构同源区域，在介导成员之间的二聚体化过程中起重要作用。Bcl-2成员之间的二聚体化是成员之间功能实现或功能调节的重要形式。除Bak之外，大部分Bcl-2家族蛋白通过羧基末端的疏水基插入到线粒体外膜上［3］。

目前的研究绝大多数着重揭示的是Bcl-2家族在线粒体与细胞质中如何发挥功能［4］。对Bcl-2家族成员的研究发现，Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中由其抗凋亡成员和促凋亡成员之间协同作用，通过线粒体途径共同决定细胞是否进入凋亡程序。

1 抗凋亡蛋白

1.1 Bcl-2

Bcl-2的亚细胞定位已经明确，它在不同的细胞类型可以定位于线粒体、内质网以及核膜上，并通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用。此外，Bcl-2具有保护细胞的功能，Bcl-2的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽（GSH）的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低了Caspase的活性。有报道，Bcl-2经蛋白酶催化裂解后则转变为促凋亡蛋白质分子,因而可刺激Cyt c释放［5］。

1.2 Bcl-xL

Bcl-xL是Bcl-2蛋白家族中重要的抗凋亡蛋白［6］，Bcl-xL基因敲除的小鼠表现出比Bcl-2敲除小鼠(几个月内死于肾衰竭)更严重的表型，胚胎13天即死亡。Bcl-xL为一凋亡相关基因，具有两种RNA拼接形式—长型Bcl-xL及短型bcl-xS，其中BclxLmRNA编码的蛋白功能类似Bcl-2，可使细胞耐受细胞生长因子撤除诱导的凋亡［7］。Bcl-xL可能作为一种新的耐药途径，通过抑制化疗药物诱发的白血病细胞凋亡参与多药耐药的形成，可以作为预测耐药及判定预后的一种参考指标。Bcl-xL在某些肿瘤细胞中的高表达与细胞耐药相关［8-10］。

1.3 Bcl-w

一些Bcl-w缺失的大鼠也没有生育能力［11］。

1.4 Mcl-1

Mcl-1是现场所有血细胞（包括免疫系统细胞）的干细胞存活必须的。Mcl-1是个抗凋亡因子，它阻止引导凋亡的Bax和Bak的激活。Mcl-1在保持早期造血干细胞的动态平衡中有特异的，关键的作用［12］。

Mcl-1在去IL-6饥饿所引发的XG-7细胞凋亡过程中具有重要作用［13］。Mcl-1基因沉默增强了二烯丙基二硫(DADS)诱导的细胞凋亡作用，shRNA介导Mcl-1基因沉默可导致HepG2细胞凋亡。靶向Mcl-1基因的RNA干扰可能是肝癌治疗的有效途径之一。

1.5 CED-9

线虫作为一种模式生物是动物细胞凋亡研究的极好材料。CED-9是Bcl-2抗凋亡蛋白家族中的成员，是调控线虫细胞凋亡的关键蛋白质。通过与促凋亡蛋白CED-4结合，对CED-4在细胞内的定位产生影响，从而改变下游的CED-3的活性，最终调控细胞凋亡。同时，CED-9自身的活性受到另一种促凋亡蛋白EGL-1的调控，EGL—1诱导CED-9的构象发生变化，两者形成稳定的复合物，同时CED-4从CED-9上脱离并释放到细胞质中，进而激活CED-3，使细胞发生凋亡。

2 促凋亡蛋白

2.1 Bcl-rambo

Kataoka等发现了Bcl-2家族蛋白的一个新成员：Bclrambo,它和Bcl-xL一样也具有与Bcl-2同源的四个保守结构域(BH1、BH2、BH3和BH4),但与Bcl-2和Bcl-xL不同的是,Bclrambo 没有抗凋亡活性,而具有促凋亡活性［14］。

2.2 Bid

Bid蛋白是Bcl-2家族中促凋亡类的蛋白。它具有可被caspase 8酶切调控、高效地诱导细胞色素c从线粒体泄漏到胞浆中的功能,从而在细胞凋亡中起着重要的作用,因而倍受人们的重视。肠腺癌组织的凋亡细胞凋亡水平的降低，蛋白Bid的低表达和Bid/Bcl-xL比值的降低可能在小肠肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的作用［15］。Bid基因定位于人染色体22q11,在大多数组织均有表达。正常细胞中Bid蛋白以未活化形式存在于胞浆中,细胞凋亡时,死亡受体途径中激活的caspase-8剪切掉其N端的氨基酸,使其活化成tBid,可与Bcl-2家族中的Bax、Bak相互作用,增效Bax、Bak调控线粒体膜通透性的作用,促进细胞色素C释放,促进细胞凋亡［16-18］。在细胞凋亡死亡受体途径中发挥非常重要的作用,也是联系死亡受体途径和线粒体途径的桥梁。

2.3 Bax

Bax是一种Bcl-2家族的前凋亡蛋白，一般出现在胞浆中，并作为一种细胞损伤和刺激的传感器。响应损伤和刺激，Bax将重新定位于线粒体表面并破坏在正常状态下抗凋亡的Bcl-2蛋白的功能［19］。一般来说，在胞浆中的Bax以单体形式存在，然而在细胞发生凋亡时，与线粒体关联的Bax既可能以无活性的单体形式存在，也可能以与线粒体膜结合的大分子量的活性复合物形式存在。Bax可以构成跨线粒体外膜的孔，并导致膜电位的降低和细胞色素C（Cyt C）及凋亡诱导因子（AIF）的外流，从而引起凋亡［20］。Bcl-2与Bax基因均与大肠腺癌的细胞凋亡的调控有关，在此过程中二者也相互作用，并且可能在大肠腺癌分化的中晚期共同调控，以抑制细胞凋亡作用为主。大肠腺癌中的细胞凋亡与肿瘤的恶性程度有关，恶性程度越大，细胞凋亡越少；Bcl-2与Bax基因均与大肠腺癌的细胞凋亡的调控有关，在此过程中二者也相互作用，并且可能在大肠腺癌分化的中晚期共同调控，以抑制细胞凋亡作用为主［21-22］。

2.4 Bak

Bak和Bax有相似的结构，之前研究人员一直认为它们在细胞凋亡过程中发挥主要的、相似的作用［23］。这两种蛋白对线粒体损伤和随后的细胞凋亡非常重要。Bak和Bax在细胞中很有可能其它蛋白控制在正常，当某些事情超出了细胞的控制能力时，Bax和Bak被激活，启动细胞死亡。某些类似蛋白（最大的是细胞色素C）是线粒体日常工作如产能所必需的，但如果从线粒体中释放出来，会启动细胞凋亡［24］。研究人员观察促进细胞凋亡的Bak蛋白与抑制细胞凋亡的Bcl-xL蛋白对胰腺癌发生、进展、转移及预后的影响。得出：Bak蛋白的表达与细胞凋亡呈正相关趋势，Bcl-xL则呈负相关趋势。细胞凋亡主要影响胰隙癌的发展、转移及预后。Bak蛋白可作为胰腺癌预后评估的一项指标和一种抗癌基因有望用于胰腺癌治疗［25-26］。

2.5 Bcl-xS

Bcl-2和Bcl-xS可通过抑制Bcl-2的功能而起到促细胞凋亡作用。Bcl-xS基因在体内有诱导细胞凋亡的作用。Bcl-xs能显著增加鼻咽癌CNE－2Z细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性［27］。

2.6 Bad(Bcl-xl/Bcl-2相关死亡蛋白)

Bad作为一种新发现的Bcl-2家族凋亡促进基因,其被认为是连接胞内存活/凋亡信号与线粒体凋亡机制的重要因子,故在肿瘤发生中所起的作用一直受到重视。研究表明在正常细胞中,Bad分布在胞质，当有凋亡信号时,Bad转位到线粒体,与Bcl-xl或者Bcl-2结合形成异二聚体,灭活Bcl-2和Bcl-XL抗凋亡效应,从而促进细胞凋亡。Bad是首先从鼠的cDNA文库克隆鉴定出的促凋亡基因,其后又克隆出人的同源基因,它属于bcl-2家族成员。它存在Bcl-2家族成员BH3同源结构域和序列。与Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-xL相似,BH3结构域是Bad与Bcl2家族蛋白结合所必需的,突变的Bcl-2和Bcl-xL不能与Bax、Bak 结合,而Bad却可以与它们结合［28-30］，在Bcl-2和Bcl-xL过表达的情况下,Bad可直接诱导凋亡,具有治疗意义［31-32］。

2.7 Bik

Bik能诱导肿瘤细胞的凋亡，Bik主要通过细胞内凋亡信号通路介导细胞凋亡,Bik过表达导致细胞发生凋亡。线粒体在细胞凋亡发生过程中,起着关键的作用,也一直是凋亡研究的重点。本研究也证实,Bik引起线粒体膜电位发生极化,并促使线粒体膜间隙的CytC的释放。线粒体介导的凋亡信号通路过程中,起始信号即线粒体膜通透性的改变导致Cyt C的释放,Cyt C同其他凋亡相关分子形成凋亡小体,该小体促使caspase-9前体的剪切,产生具有酶活性的caspase-9。内质网介导的凋亡信号通路在Bik诱导的凋亡中的作用通过构建Bik和EGFP融合蛋白:PCDNAEGFP-Bik(表达EGFP-Bik融合蛋白和PCDNA-EGFP-Bik(表达的EGFP-Bik融合蛋白不含Bik的跨膜结构域)。钙离子信号可能是Bik定位于内质网后,一个重要的第二信使,进而传递下游的凋亡信号。Bik主要从内质网发动凋亡信号,而caspase-12可能是内质网钙离子释放引起的下游信号。

2.8 Bim

Bim是Bcl-2家族中仅含有一个BH3结构域的蛋白，具有助凋亡活性，Bim直接激发糖皮质激素（GC）诱导的急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的凋亡，与ALI.对GC的敏感性有关，Bim的下调可能是ALL GC耐药的重要机制之一。Bim是蛋白酶体抑制剂bortezomib抗肿瘤活性的介质之一，用Bim基因表达载体转染肿瘤细胞有可能成为肿瘤基因治疗的新途径。

总之，细胞凋亡的分子机制很复杂，Bcl-2 家族在细胞凋亡机制中发挥着不可忽视的作用。对它的研究有利于揭示很多疾病的机制，如肿瘤、老年痴呆、艾滋病、自身免疫病等。也可以根据凋亡理论为肿瘤、老年痴呆、自身免疫病和艾滋病寻找新的有效的药物。

［1］Peter ME,Heufelder AE,Hengartner MO.Advances in apoptosis research［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1997；94:12736-12737.

［2］Scholz C,Richter A,Lehmann M,et al.Arsenic trioxide in-duces regulated,death receptor-independent cell death through a Bcl-2-controlled pathway［J］.Oncogene,2005,24(47):7031-7042.

［3］沈茜,苏浩,张林杰.Bcl-2家族成员在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡中的表达［J］.中国现代医生.2008,46（21）：162-164.

［4］Boise LH,Gonzalez－Carcia M,Postema CE,et al.bcl－x,a bcl－2－related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death ［J］.Cell,1993,74(4):597-608.

［5］Kirsch DG,Doseff A,Chau BN,et al.Caspase-3 dependent cleavage of Bcl-2 promotes release of cytochrome c［J］.J Biol Chem,1999,274(30):21155-21161.

［6］2Kuhl JS,Krajewski S,Duran GE,et al.Spontaneous overexpression of the long form of the Bcl－X protein in a highly resistant P388 leukemia ［J］.Br J Cancer,1997,75(2):268-274.

［7］Boise LH,Gonzalez－Carcia M,Postema CE,et al.bcl－x,a bcl－2－related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death ［J］.Cell,1993,74(4):597-608.

［8］卢红梅，强亦忠，施勤.凋亡相关基因Bcl-XL、Bax表达与人卵巢癌细胞辐照凋亡效应的相关性研究［J］，江苏临床医学杂志，2002,6(6),522-523.

［9］Han Z,Chatterjee D,Early J,et al. Isolation and characterization of an apoptosis－resistant variant of human leukemia HL－60 cells that has switched expression from Bcl－2 to Bcl－XL［J］.Cancer Res,1996,56(7):1621-1628.

［10］白庆咸,黄高升,陈协群.重组bcl－xL逆转录表达载体的构建及鉴定［J］.第四军医大学学报,1997,18(5):封3.

［11］Knudson CM,Tung KS,Tourtellotte WG,et al.Bax-deficient mice with lymphoid hyper-plasia and male germ cell death［J］.Science,1995,270（5233）:96-99.

［12］Opferman JT,Iwasaki H,Ong cc. Obligate role of antiapoptotic MCL-1 in the survival of hematopoietic stem cells［J］.Scien ce,2005,307(5712):1101-1104.

［13］宋伦,黎燕,孙英勋,等.Mcl—1介导去因子饥饿诱导的人骨髓病细胞系XG—7凋亡［J］.中华医学杂志（英文版）,2002，115(8):1241-1243.

［14］Kataoka T,Holler N,Micheau O,et al.Bcl-rambo,a novel Bcl-2 homologue that induces apoptosis via its unique terminal extension［J］.J Biol Chem,2001;276(22):19548-19554.

［15］郭文娟，王爱英，高春.小肠腺癌组织的细胞凋亡及相关蛋白Bid和Bcl-xL的表达及意义［J］.世界华人消化杂志，2010，18(11):1127-1133.

［16］Luo X,Budihardjo I,Zou H,et al.Bid,a Bcl-2 interacting protein,mediates cytochrome c release fiom mitochondria in response to activation of cell surface death receptors ［J］.Cell,1998，94(4):481-490.

［17］Gross A,Yin X M,Wang K,et al.Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release,while BCL-XL prevents this release but not tunor necrosis factor-R1/Fas death［J］.J Biol Chem,1999，274(2):1156-1163.

［18］Li H,Zhu H,Xu C,et al.Cleavage of BID by caspase8mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis［J］.Cell,1998，94(4):491-501.

［19］郭琳琅,曹长安,郭颖.肝硬变和肝癌组织bcl-2及相关蛋白bax的表达及意义［J］.实用癌症杂志,1998，13(3):204-205.

［20］李松建，黄耀添，王臻，促凋亡基因bax在骨巨细胞瘤中的表达及意义［J］.中国肿瘤临床，1999，22(3):194-195.

［21］乔庆，吴金生，张静，等.凋亡相关基因bcl-2, bax在人类大肠腺癌中的表达意义［J］.世界华人消化杂志，1999，7（11）:199.

［22］ltvai Z, Milliman C, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog. Bax, that accelerates programmed cell death［J］.Cell,1993，74:609.

［23］Pataer A, Fang B, Yu R,et al. Adenoviral Bak overexpression mediates caspase-dependent tumor killing. Cancer Res,2000,60:788-792.

［24］Ruffolo SC, Shore GC. Bcl-2 selectively interacts with the BIDinduced open conformer of BAK, inhibiting BAK autooligomerization. J Biol Chem 2003,278:25039-25045.

［25］Kondo S, Shinomura Y, Miyazaki Y,et al. Mutations of the bak gene in human gastric and colorectal cancers. Cancer Res 2000,60:4328-4330.

［26］Zhou XM, Wong BC, Fan XM,et al. Non-steroidal antiinflammatory drugs induce apoptosis in gastric cancer cells through upregulation of bax and bak. Carcinogenesis 2001,22:1393-1397.

［27］陈扬超，张月飞,周克元，等.bcl—xs增加鼻咽癌细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2001，8(2):84-87.

［28］Ottilie S, Diaz JL, Horne W, et al. Dimerization properties of human BAD. Identification of a BH3 domain and analysis of its binding to mutant bcl2 and bclxL proteins［J］.Biol Chem,1997,272 (49)∶30866.

［29］Kelekar A , Chang BS , Harlan J E, et al. Bad is a BH23 domaincontaining protein that forms an inactivating dimer with bcl-xL［J］. Mol Cell Biol,1997,17(12)∶7040.

［30］Hong JR , Wu JL. Induction of apoptotic death in cells via bad gene expression by infectious pancreatic necrosis virus infection［J］. Cell Death Differ,2002,9(2):113.

［31］Schimmer AD, Hedley, Pham NA, et al.BAD induces apoptosis in cells overexpressing Bcl2 or BclxL without loss of mitochondrial membrane potential［J］. Leuk Lymphoma,2001，42(3)∶429.

［32］Hattori T , Ookawa N , Fujita R , et al. Heterodimerization of bcl2 and bclx (L) with bax and bad in colorectal cancer［J］. Acta Oncol,2000，39(4)∶495.