益生菌制剂对早期断奶仔猪肠道p H、黏膜形态结构和挥发性脂肪酸含量的影响

刘虎传 张敏红 李素霞 冯京海 姜海龙 杨家军 殷瑞娟

肠道是重要的营养吸收器官，肠道上皮还是阻止外界环境有害物质入侵机体的重要屏障。肠道屏障是由肠上皮、上皮间紧密连接及基底膜等构成。应激损伤肠道屏障功能，导致肠道内毒素入侵体内。肠道完整性的损伤会引起肠道通透性的增加，导致从生理到病理炎症的转变，这也是肠道疾病的一个重要特征［1］。断奶应激对仔猪肠道功能的影响一直备受关注。严汝南［2］报道3～4周龄仔猪断奶会破坏肠道的正常微生物区系和绒毛结构。断奶会引起仔猪的血液生化和免疫指标发生显著变化，如乳酸脱氢酶活力显著上升，免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、免疫球蛋白A、总蛋白、白蛋白、球蛋白水平迅速下降［3］。某些血清激素水平及细胞免疫功能也受到影响，如血清皮质醇水平显著升高，血清甲状腺素、游离甲状腺素、生长激素、胰岛素水平显著降低，淋巴细胞转化率和白细胞吞噬率显著降低［4］。因此，改善应激条件下仔猪肠道的屏障功能可能为缓解断奶应激提供一种有效途径。

益生菌是指摄入一定量后能对宿主产生益生作用的活的微生物［5］。益生菌能改善肠道屏障功能，调节肠道免疫系统。Scharek等［6］在仔猪饲粮中添加屎肠球菌能提高早期肠道微生物的定植，降低病原菌的数量。Lodemann等［7］通过猪的益生菌作用模型研究，发现屎肠球菌NCI MB 10415可降低病原菌在健康仔猪肠道中的数量。Takahashi等［8］发现在饲粮中添加植物乳杆菌能增加肠道中乳酸杆菌的数量。Siggers等［9］给新生仔猪饲喂乳酸杆菌和双歧杆菌的复合菌，促进了有益微生物的定植，能够降低人工诱导的黏膜萎缩、肠功能性障碍。Collado等［10］发现双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌能显著降低沙门氏菌、大肠杆菌和厌氧芽孢梭菌在猪肠道黏膜上的黏附。大量研究表明，益生菌具有缓解断奶应激的潜力，但其作用机制并不十分清楚。益生菌的益生功效与它的属、种和菌株本身有关。Sanders等［11］研究了不同益生菌属、种和菌株对宿主的益生作用，发现复合的菌株或菌种比单一菌株更有效。目前，混合不同属或种的益生菌制剂是一个研究热点。关于益生菌制剂对早期断奶仔猪小肠各部位黏膜形态的影响报道很少。本试验通过测定仔猪肠道p H、黏膜形态结构和挥发性脂肪酸含量，探讨由屎肠球菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌组成的益生菌制剂对缓解早期仔猪断奶应激的作用效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

益生菌制剂包含1.6×1011CFU／g屎肠球菌，1.1×1011CFU／g植物乳杆菌和1.3×1011CFU／g枯草芽孢杆菌，所用菌粉购自亚芯（南京）生物科技有限公司。

1.2 动物与分组

试验选取（21±2）日龄的初始平均体重为（6.39±0.42）kg“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪48头，按性别、体重和窝源基本一致原则，随机分为2个组，每个组4个重复，每个重复6头猪。

1.3 基础饲粮及饲养管理

参照NRC（1998）5～10 kg仔猪饲养标准配制玉米－豆粕型基础饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表1。试验1组为对照组，采用基础饲粮；试验2组为益生菌组，每千克基础饲粮中添加1×109CFU活菌。试验在河北邢台金凤种猪场进行。全封闭猪舍，红外灯保温。粉料饲喂，乳头式饮水器，自由采食和饮水。按照猪场常规管理程序进行免疫驱虫。试验期为21 d。

表1 基础饲粮组成及营养水平（饲喂基础）Table 1 Co mposition and nutrient levels of the basal diet（as－fed basis） %

1.4 样品的采集与处理

21、28、35和42日龄时，从每个组的每个重复中随机选取1头猪屠宰，剪取空肠前1／4段、空肠后1／4段、回肠中段肠管（3 c m），立即测定肠道内容物p H，然后用生理盐水冲洗净内容物，将肠道组织置于10%甲醛磷酸缓冲液中固定，用于测定肠黏膜形态结构；选择盲肠结扎，取出带有食糜的肠段，测定内容物p H，然后液氮中保存，用于内容物挥发性脂肪酸含量的测定。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 p H测定

用雷磁SJ－4 A型p H计测定空肠前1／4段、空肠后1／4段、回肠中段和盲肠内容物的p H。

1.5.2 肠道黏膜形态结构测定

固定后的肠道组织样品经脱水以石蜡包埋，连续切片（5μm），以苏木精－伊红（HE）对切片进行染色。用显微镜观察肠道黏膜结构，并以Motic Med 6.0图像软件分析。每张切片测定10根完整绒毛的绒毛高度和隐窝深度，选择5张切片计算每个组织的平均值。

1.5.3 肠道上皮内淋巴细胞数量测定

HE染色后的5张切片，每张选择5个视野对上皮细胞和上皮内淋巴细胞计数。上皮内淋巴细胞计数表示为每100个上皮细胞对应的上皮内淋巴细胞数量。

1.5.4 肠道杯状细胞数量测定

以高碘酸－希夫（PAS）对杯状细胞进行染色。选择5张切片，每张切片选择5个视野对杯状细胞进行计数。杯状细胞计数表示为每100个上皮细胞对应的杯状细胞数量。

1.5.5 盲肠内容物中挥发性脂肪酸含量测定

盲肠内容物中乙酸、丙酸和丁酸含量采用Agilent 6890气相色谱仪测定，乳酸含量采用戴安CS－3000离子色谱仪测定。结果表示为内容物每克湿重所含挥发性脂肪酸的重量（mg／g）。

1.6 统计分析

用SAS 9.1.3统计软件对各项数据进行t检验。结果以平均值±标准差表示，显著性水平表示为P＜0.05。

2 结 果

2.1 益生菌制剂对空肠、回肠和盲肠内容物p H的影响

由表2可知，28日龄时，益生菌组回肠内容物p H显著低于对照组（P＜0.05）；其他日龄益生菌组各肠道组织内容物p H有低于对照组的趋势，但差异不显著（P＞0.05）。

2.2 益生菌制剂对空肠、回肠黏膜形态结构和上皮内淋巴细胞及杯状细胞数量的影响

由表3可知，28日龄时，益生菌组空肠绒毛高度和上皮内淋巴细胞数量显著高于对照组（P＜0.05）；35日龄时，益生菌组空肠绒毛高度和上皮内淋巴细胞数量显著高于对照组（P＜0.05），隐窝深度显著低于对照组（P＜0.05）；42日龄时，益生菌组空肠绒毛高度、上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量显著高于对照组（P＜0.05），隐窝深度显著低于对照组（P＜0.05）。

表3 益生菌制剂对空肠黏膜形态结构和上皮内淋巴细胞及杯状细胞数量的影响Table 3 Effects of pr obiotic preparation on jejunal mucosal morphology and the nu mber of IELs and goblet cells

由表4可知，28日龄时，益生菌组回肠绒毛高度、上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量显著高于对照组（P＜0.05），隐窝深度显著低于对照组（P＜0.05）；35日龄时，益生菌组回肠绒毛高度显著高于对照组（P＜0.05），隐窝深度显著低于对照组（P＜0.05）；42日龄时，益生菌组回肠绒毛高度显著高于对照组（P＜0.05）。

表4 益生菌制剂对回肠黏膜形态结构和上皮内淋巴细胞及杯状细胞数量的影响Table 4 Effects of pr obiotic preparation on ileal mucosal morphology and the nu mber of IELs and goblet cells

2.3 益生菌制剂对盲肠内容物中挥发性脂肪酸含量的影响

由表5可知，28日龄时，益生菌组盲肠内容物中丁酸和乳酸含量显著高于对照组（P＜0.05）；35日龄和42日龄时，益生菌组盲肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸和乳酸含量显著高于对照组（P＜0.05）。

3 讨 论

3.1 益生菌制剂对断奶仔猪盲肠内容物中挥发性脂肪酸含量及p H的影响

猪等单胃动物的微生物发酵主要发生在盲肠、结肠及直肠部位，其中盲肠挥发性脂肪酸含量最高［12］。仔猪肠道微生物发酵碳水化合物可以产生多种挥发性脂肪酸，主要包括甲酸、乙酸、丙酸和丁酸，另外还可产生大量的乳酸［13］。这些小分子酸对仔猪肠道的健康起重要作用。Högberg等［14］研究发现，当饲粮中益生菌含量升高时，仔猪肠道中挥发性脂肪酸的含量显著增加，同时p H显著降低。挥发性脂肪酸含量的升高，可以发挥抑菌效应，增加肠道营养物质的吸收。Giang等［15］在仔猪饲粮中添加益生菌制剂，14日龄和35日龄时，回肠和结肠中乳酸和乙酸的含量显著增加，35日龄时，回肠中丙酸含量也显著增加。辛娜等［16］研究发现芽孢杆菌能显著降低空肠和盲肠的p H。苏勇等［13］发现芽孢乳杆菌能显著提高35日龄仔猪结肠乙酸、丙酸和丁酸的含量。本试验中，仔猪添加益生菌制剂也得到类似的结果，盲肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸和乳酸含量上升，而p H有所降低。

表5 益生菌制剂对盲肠内容物中挥发性脂肪酸含量的影响Table 5 Effects of pr obiotic preparation on volatile f atty acid content in cecal digesta mg／g

3.2 益生菌制剂对断奶仔猪空肠、回肠黏膜形态结构和上皮内淋巴细胞及杯状细胞数量的影响

肠绒毛是小肠上皮和固有层共同向肠腔突出形成的细小突起，可使肠腔的面积扩大约10倍，极大地增加了营养物质的吸收面积。一般情况下，隐窝基部的细胞不断地分化并向绒毛的端部迁移，形成具有吸收能力的肠上皮细胞以补充绒毛正常脱落的肠上皮。仔猪断奶后，肠道黏膜萎缩，肠道黏膜上皮绒毛变短，隐窝变深，肠绒毛成熟细胞数量减少［17］。绒毛变短，隐窝变深会减少营养物质的吸收，降低动物的生产性能。顾宪红等［18］比较了不同断奶日龄对仔猪肠黏膜形态的影响，发现断奶日龄越早，仔猪肠黏膜变化越大，其中绒毛高度下降幅度越大，恢复时间越长，一般在断奶后8～12 d降至最低，随后恢复较快。本试验研究发现，益生菌组绒毛高度显著高于对照组，隐窝深度也低于对照组，说明益生菌制剂为肠道细胞提供了较好的保护作用。

上皮内淋巴细胞分布于肠道上皮细胞之间，与基底膜临近，由多类群的T细胞组成，是机体与食物和细菌抗原最早、最频繁接触的淋巴细胞，因而形成了肠道免疫系统的第一道防线。已有研究表明，应激可诱导小鼠肠道上皮内淋巴细胞的凋亡［19］，而益生菌能增加肠道中上皮内淋巴细胞数量，并 减 少 其 凋 亡［20］。 顾 宪 红 等［21］研 究 发 现 ，28日龄断奶仔猪小肠各段上皮内淋巴细胞数量显著高于17日龄、21日龄和35日龄断奶仔猪，而21日龄断奶仔猪小肠各段上皮内淋巴细胞数量显著低于其他3个日龄组。本试验添加益生菌制剂后，断奶仔猪空肠、回肠上皮内淋巴细胞数量得到了一定的增加。

杯状细胞覆盖于肠道上皮细胞表面，分泌黏液物质，其主要是黏蛋白。黏蛋白是一种糖蛋白，在管腔内成为润滑性黏液涂布于肠上皮表面，与柱状细胞分泌的复合糖蛋白一起构成肠道黏膜上皮细胞表面的细胞衣，而细胞衣的糖蛋白和细胞膜的蛋白质和脂质牢固结合，可捕获微生物，阻挡病原微生物和有害物质的破坏，是潜在致病源的重要物理屏障［22］。随肠段后移，杯状细胞也逐渐增多。应激时，肠道杯状细胞能快速分泌黏液素以增强肠道的屏障功能，但长期的慢性应激会导致杯状细胞的枯竭，从而对后续应激和新应激的反应能力减弱。断奶越早、日龄越小的仔猪肠上皮间杯状细胞数量越多［22］。陈旭东［23］研究发现，芽孢杆菌能显著增加断奶仔猪回肠和盲肠杯状细胞的比例。丁酸钠［22］和复方中药制剂［24］等也均能增加仔猪小肠黏膜杯状细胞数量。本试验也得到类似的结果，添加益生菌制剂显著增加了28日龄回肠和42日龄空肠的杯状细胞数量，表明益生菌制剂有稳定杯状细胞分泌，提高仔猪免疫力，缓解断奶应激的作用。

4 结 论

① 添加益生菌制剂能缓解早期断奶应激对绒毛高度和隐窝深度的影响，提高肠道内淋巴细胞数量。

② 添加益生菌制剂能增加盲肠内容物中挥发性脂肪酸含量，降低肠道p H。

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