Ezrin与 NF-κBp65、ICAM-1在胃癌组织及区域转移淋巴结中的表达及意义

张文军 杨洪颖 申策 李茂恒 郑宏江 左燕红

胃癌在转移进展过程中将出现异质性(Heterogeneity)变化，导致肿瘤细胞的侵袭、转移、耐药性等与原发灶不同［1－3］。了解胃癌转移组织中肿瘤细胞的特征对探讨胃癌侵袭转移规律有重要意义，但目前有关胃癌转移灶肿瘤细胞侵袭转移情况的报道还很少见。埃兹(Ezrin)基因是新近发现的与多种恶性肿瘤关系密切的新基因，可促进多种恶性肿瘤的侵袭和转移［4，5］。因此，本研究检测了Ezrin蛋白在胃癌及区域转移淋巴结中的表达情况，并对其意义进行了分析。为了解Ezrin蛋白在胃癌侵袭转移中的作用机制，本研究同时检测了细胞核转录因子(NF-κB)p65、细胞间黏附因子-1(ICAM-1)在原发肿瘤和区域转移淋巴结中的表达，并对三者间的关系进行了分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析选择2006年10月至2009年10月在我科手术并有术后病理证实淋巴结转移阳性的胃癌石蜡标本36例，其中男25例，女11例;年龄38～75岁，平均年龄(60±10)岁。所有病例术前均未接受任何治疗。每例患者的胃癌组织、相应转移淋巴结标本均经HE染色病理确诊。兔抗人Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1多克隆抗体均购自美国 Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术公司，

1.2 免疫组化染色测定 Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1蛋白表达

石蜡包埋标本4 μm连续切片后进行HE和免疫组化染色。切片脱蜡水化，3%过氧化氢孵育、蒸馏水冲洗，以磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡后进行抗原修复。以下严格按试剂盒说明操作:工作液封闭、加入一抗、孵育并冲洗后依次加二抗工作液、辣根酶标记链酶卵白素工作液。二氨基胺苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水，中性树脂封片。

1.3 结果判断 染色结果由两位病理学医师进行双盲阅片判断结果。每张切片随机取5个高倍视野(×400)，每视野均计数100个细胞，计算细胞的阳性率。Ezrin、ICAM-1主要表达在细胞膜和细胞浆内，以出现黄色或棕黄色颗粒为染色阳性;NF-κBp65以细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为染色阳性。Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1的记分标准:细胞内无阳性表达为(－)，＜50%细胞阳性表达为(+)，≥50%细胞阳性表达为(++)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 15.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关性采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和区域转移淋巴结灶中Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1表达情况 Ezrin、NF-κBp65在区域转移淋巴结中表均强于胃癌原发灶(P＜0.05)，在两种组织间ICAM-1表达强度差异无统计学意义(P＞0.05)。Ezrin、NF-κBp65 在胃癌原发灶、区域转移淋巴结间表达呈正相关性(P＜0.05)，而ICAM-1在两种组织中表达无相关性(P＞0.05)。见表1。

表1 Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1在胃癌和区域转移淋巴结组织中的表达 例

2.2 胃癌原发灶及区域转移淋巴结中Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1三种蛋白质的相关关系 胃癌组织中Ezrin与NF-κBp65表达存在正相关关系(r=0.3894，P＜ 0.05)，NF-κBp65 与ICAM-1表达存在正相关关系(r=0.3649，P＜0.05);Ezrin与ICAM-1表达无明显相关关系(r=0.2867，P＞0.05);在区域转移淋巴结组织中各因子间无明显相关关系(r值分别为0.3022，0.2756，0.2928，P＞0.05)。

3 讨论

Ezrin蛋白是ERM蛋白家族成员之一，在细胞的生长过程中发挥重要作用，并且具有调节细胞信号转导、黏附状态等功能［6］。近年发现，Ezrin蛋白在包括胃癌在内的多种肿瘤中存在过表达，与肿瘤的侵袭转移密切相关［4，5，7］。胃癌细胞具有很强的侵袭转移能力，大多数就诊的胃癌患者处于进展期，存在转移灶。随着胃癌诊治技术的进步，目前临床上对于转移灶的治疗已成为研究热点，如能有效抑制转移灶将大大提高胃癌综合治疗效果、改善预后。由于胃癌细胞在转移过程中许多分子都发生了变化，因此，分析转移灶与原发肿瘤间的分子差异对了解胃癌转移规律、寻找治疗靶位有重要意义。故本研究对Ezrin等蛋白质在胃癌原发灶、区域转移淋巴结中的表达进行了检测。结果发现，与原发肿瘤比较，Ezrin蛋白在胃癌区域转移淋巴结的表达更强，说明该蛋白在胃癌转移过程中发生了变化，这种变化导致转移灶中的肿瘤细胞具有更强的侵袭转移能力。本结果还显示，在两种组织中Ezrin蛋白表达具有相关性，这提示胃癌转移过程中Ezrin蛋白的变化有一定规律，但具体机制尚待进一步研究。

为进一步了解造成Ezrin蛋白在转移淋巴结中表达变化的机制，我们进一步检测了NF-κBp65、ICAM-1的表达情况。NF-кB是一种核转录蛋白，在体内多种组织中均有存在，且在多种恶性肿瘤中高表达，该蛋白可通过对相关基因的转录调控，推进细胞周期演进并抑制凋亡，在细胞癌变过程中发挥重要作用［8］。Gavert等［9］的研究显示，NF-кB 通路激活可促进 Ezrin蛋白表达，在结肠癌转移过程中发挥重要作用。因此，本研究对NF-кB家族中作用明确的NF-κBp65蛋白进行了检测。结果显示，NF-κBp65蛋白在胃癌转移淋巴结中表达强于原发肿瘤，说明该蛋白在转移过程中发生了变化。结果还显示，原发肿瘤中Ezrin蛋白和NF-κBp65蛋白存在相关关系，提示二者存在调控关系;但在区域转移淋巴结中并未发现二者有关，我们推测这是由于胃癌转移是极其复杂的过程，多种蛋白质和信号转导通路参与其中，导致转移淋巴结中Ezrin蛋白和NF-κBp65蛋白关系并不明显。另外，本研究还检测了ICAM-1的表达情况。ICAM-1在肿瘤免疫中发挥重要作用，可以促进肿瘤的转移进展;也有研究显示［10］，ICAM-1表达与Ezrin蛋白有关。本结果同样发现在原发肿瘤中二者存在一定关系，但转移淋巴结中并未发现二者有关。我们同样认为这是由于胃癌转移过程的复杂性造成的。

由于胃癌转移是多种机制、多种转移相关因子相互间共同作用的结果，Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1仅是其中部分因素。因此，评价Ezrin蛋白与肿瘤胃癌转移关系时必须考虑其他相关因素的影响。总之，本研究证实Ezrin蛋白与胃癌转移有密切关系，深入探讨其作用对胃癌转移机制研究有重要意义。

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6 He ZY，Wen H，Shi CB，et al.Up-regulation of hnRNP A1，Ezrin，tubulin β-2C and Annexin A1 in sentinel lymph nodes of colorectal cancer.World J Gastroenterol，2010，16:4670-4676.

7 Zhao J，Zhang X，Xin Y.Up-regulated expression of Ezrin and c-Met proteins are related to the metastasis and prognosis of gastric carcinomas.Histol Histopathol，2011，26:1111-1120.

8 Niu J，Wang K，Graham S，et al.MCP-1-induced protein attenuates endotoxin-induced myocardial dysfunction by suppressing cardiac NF-кB activation via inhibition of IкB kinase activation.J Mol Cell Cardiol，2011，51:177-186.

9 Gavert N，Ben-Shmuel A，Lemmon V，et al.Nuclear factor-kappaB signaling and ezrin are essential for L1-mediated metastasis of colon cancer cells.J Cell Sci，2010，123:2135-2143.

10 Romero IA，Amos CL，Greenwood J，et al.Ezrin and moesin co-localise with ICAM-1 in brain endothelial cells but are not directly associated.Brain Res Mol Brain Res，2002，105:47-59.