黄芩苷干预肺腺癌细胞前后肿瘤细胞侵袭能力的变化

王英妹 郑海峰 武铁军 李庆祥 张健

黄芩苷(baicalin)是从唇形科植物黄芩中提取、分离出来的黄酮类化合物，是黄芩的主要有效成分之一，具有多种药理作用，如:抗菌、抗氧化、诱导干细胞分化等［1－3］。研究表明，黄芩苷具有抗肿瘤的作用，但对其具体的作用机制目前尚未明了［1］。肺腺癌是临床常见的恶性肿瘤之一。随着我国工业化进程，肺腺癌发病和病死率目前均居恶性肿瘤前列，对人民健康危害极大。手术和化学治疗在肺腺癌治疗中占有很重要的地位，但存在一定的局限性和不良反应。本实验探讨了baicalin对人肺腺癌细胞A549侵袭迁移的影响，并检测了与肿瘤侵袭迁移关系密切的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9、细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)-1在用药前后表达的变化，为baicalin应用于肺腺癌的临床治疗提供一些新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株:A549肺腺癌细胞株，购自中科院上海细胞研究所。

1.1.2 药物:Baicalin购自南京青泽医药公司，纯度:99.1%。

1.1.3 主要试剂:Trizol试剂为美国 Invitrogen公司产品，RTPCR试剂盒购自 Promega公司;MMP-2、MMP-9、ICAM-1、GAPDH引物由上海生工生物工程公司设计合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞划痕试验:将肺腺癌A549细胞株传代于玻片上，生长至100%汇合后，用无菌吸头在玻片上划痕。磷酸盐缓冲液(PBS)洗净被刮下的细胞，每孔加纤连蛋白后分别加入0、0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin，对照组加等量 0.5% 二甲基亚砜(DMSO)，孵育48 h，取出玻片，低倍视野下观察细胞伤口愈合情况。随机选取5个视野，计数迁移细胞的数量，以此表示细胞的迁移活性。实验平行重复3次。计算:细胞迁移抑制率(%)=(1试验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数)×100%。

1.2.2 Transwell小室侵袭试验:采用24孔板Transwell小室进行，包被有胶原基质的Millipore滤膜孔径为8 m。分别将0、0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin 处理的肺腺癌 A549 细胞株用0.25%胰蛋白酶消化后，以105个/孔接种于上层小室，下层小室加入10%胎牛血清(FBS)培养液，37℃孵育16 h，取出滤膜用棉拭子轻轻擦掉滤膜上层的细胞，置于中甲醇固定10 min，高倍镜下随机选取5个视野计数迁移至滤膜下层的细胞，实验重复3次。抑制率(%)=(1试验组侵袭细胞的数量/对照组侵袭细胞的数量)×100%。

1.2.3RT-PCR方法测定:MMP-2、MMP-9及 ICAM-1 mRNA 的表达2 mg/L baicalin处理肺腺癌A549细胞株48 h，收集细胞，Trizol一步法提取总RNA，按试剂盒说明进行反转录反应和PCR，扩增目的片段。设定PCR反应条件:95℃、5 min;然后，95℃ 30 s、58℃ 20 s、72℃ 30 s，进行 25 个循环，72℃ 延伸10 min。PCR片段经2%琼脂糖电泳分离，凝胶成像仪扫描成像，并进行光密度分析。GAPDH基因作为内参照。各目的基因扩增片段光密度值/内参照密度值，将此比值进行比较。所用引物序列见表1。

表1 PCR所用引物序列

1.3 统计学分析应用SPSS 11.0统计软件，计量资料以±s表示，进行ANOVA分析处理和Dunnett检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度baicalin对肺腺癌A549细胞株迁移侵袭能力的影响 细胞划痕实验显示，0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin 作用于肺腺癌A549细胞株后，对肺腺癌A549细胞株平面迁移活性均有不同程度的抑制作用，抑制率分别为(9.1±1.6)%、(19.4±3.1)%、(42.7 ± 6.4)%、(47.6 ± 6.9)%、(49.3 ± 7.7)%。Transwell小室侵袭实验结果显示，0.5、1、2、4、8 mg/L baicalin 作用于肺腺癌A549细胞株后16 h，细胞跨膜迁移活性的抑制率分别为(8.5 ±1.3)%、(17.4 ±2.9)%、(40.1 ±6.5)%、(45.5±6.9)%、(48.8 ±7.3)%。

2.2 Baicalin对人肺腺癌细胞株 A549 MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表达的影响 RT-RCR结果显示，与对照组相比，2 mg/L baicalin处理人肺腺癌细胞株A549 48 h后，MMP-2、MMP-9、ICAM-1 mRNA表达明显降低(P＜0.01)。见表 2、图1。

表2 Baicalin对A549细胞MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表达的影响n=3，±s

表2 Baicalin对A549细胞MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表达的影响n=3，±s

注:与对照组比较，*P ＜0.01

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图1 Baicalin对A549细胞MMP-2、MMP-9及ICAM-1 mRNA表达的影响

3 讨论

肺腺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率居各恶性肿瘤前列，同时，由于该病起病隐匿、缺乏典型症状，大部分病例就诊时已处于中晚期，5年生存率仅约10%。目前主要治疗方法是手术治疗结合放射治疗和化学治疗等，化疗在其中发挥重要作用，但化疗药物因杀瘤效果不理想且存在较大的不良反应导致临床应用疗效不佳。因此，如何寻找疗效明确、不良反应小的药物对临床肺腺癌治疗的意义重大，新型中药开发已成为肺癌治疗研究的热点。中医认为，肺癌发生是由于人体正气虚弱又毒邪袭肺、或痰湿凝聚于肺，致机体阴阳失调，邪阻于肺而成积。黄芩苷为传统中药黄芩的主要有效成分之一，主要功效为清热燥湿、泻火解毒，已有报道黄芩苷能抑制人肝癌细胞的侵袭能力［4］，本实验探讨黄芩苷对肺腺癌A549细胞的侵袭迁移的影响及可能机制，为肺腺癌的综合治疗和新型中药开发提供依据。

肺癌细胞的侵袭迁移能力的强弱是导致肿瘤恶性程度高低的基本原因，临床绝大多数肺癌患者死于肿瘤侵袭转移。因此本研究以细胞划痕实验检测了baicalin对肺癌细胞迁移能力的影响。结果显示，各浓度baicalin对肺腺癌细胞的迁移均有抑制作用，提示baicalin可能通过抑制细胞瘤细胞的游走而抑制肺癌进展;同时本研究以Transwell小室实验评价了baicalin对肺癌细胞瘤细胞的侵袭和转移能力的影响，结果同样提示显示baicalin可明显抑制肺腺癌肿瘤细胞的侵袭能力，说明baicalin对肺癌细胞的侵袭迁移能力有良好的抑制作用。但本研究仅为起步阶段，需要进一步进行体内实验深入研究。

基质金属蛋白酶(MMPs)对基底膜中细胞外基质的降解是肿瘤浸润和转移的重要步骤之一［5，6］。MMPs家族是一类内源性蛋白水解酶，MMP-2和MMP-9即为该家族的重要成员，这两种酶的主要功能为降解明胶和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型基底膜胶原，在细胞与基质间的黏附中起着重要的作用，MMP-2、MMP-9的表达与肿瘤侵袭关系密切。有研究显示，在肺癌细胞中，MMP-2、MMP-9高表达可促进该肿瘤的浸润、转移［7］。本研究以baicalin作用于肺腺癌肿瘤细胞后发现处理组肿瘤细胞 MMP-2、MMP-9 mRNA水平明显低于对照组，表明baicalin可通过下调MMP-2、MMP-9的表达起到抗肺癌的作用。细胞间黏附因子-1(ICAM-1)可促进细胞间黏附作用加强，在肿瘤免疫中起重要作用，可以促进肿瘤的侵袭进展［8］，也有研究报道ICAM-1与肺癌侵袭关系密切［9］。本研究显示，baicalin作用于肺癌细胞后可抑制ICAM-1的表达，说明这可能也是baicalin抑制肺癌细胞侵袭的机制之一。

本研究发现baicalin对肺癌细胞的侵袭迁移能力有良好的抑制作用，值得进一步研究并进行临床试验。但本研究尚处于初级阶段，研究还欠深入，需全面分析baicalin的抗肺癌机制，以期为肺癌综合治疗做出贡献。

1 Zhang S，Jin Y，Zhu W，et al.Baicalin released from scutellaria baicalensis induces autotoxicity and promotes soilborn pathogens.J Chem Ecol，2010，36:329-338.

2 Li CT，Zhang WP，Fang SH，et al.Baicalin attenuates oxygen-glucose deprivation-induced injury by inhibiting oxidative stress-mediated 5-lipoxygenase activation in PC12 cells.Acta Pharmacol Sin，2010，31:137-144.

3 Liang XL，Liao ZG，Zhu JY，et al.The absorption characterization effects and mechanism of Radix Angelicae dahuricae extracts on baicalin in Radix Scutellariae using in vivo and in vitro absorption models.J Ethnopharmacol，2012，139:52-57.

4 Chiu YW，Lin TH，Huang WS，et al.Baicalein inhibits the migration and invasive properties of human hepatoma cells.Toxicol Appl Pharmacol，2011，255:316-326.

5 Baek MJ.Prognostic Role of MMPs in colorectal cancer.J Korean Soc Coloproctol，2011，27:105-106.

6 Roomi MW，Monterrey JC，Kalinovsky T，et al.Inhibition of invasion and MMPs by a nutrient mixture in human cancer cell lines:a correlation study.Exp Oncol，2010，32:243-248.

7 Gao M，Zhang JH，Zhou FX，et al.Angelica sinensis suppresses human lung adenocarcinoma A549 cell metastasis by regulating MMPs/TIMPs and TGF-β1.Oncol Rep，2012，27:585-593.

8 Wang QL，Li BH，Liu B，et al.Polymorphisms of the ICAM-1 exon 6(E469K)are associated with differentiation of colorectal cancer.J Exp Clin Cancer Res，2009，28:139.

9 Guney N，Soydinc HO，Derin D，et al.Serum levels of intercellular adhesion molecule ICAM-1 and E-selectin in advanced stage non-small cell lung cancer.Med Oncol，2008，25:194-200.