HPLC法同时测定人血浆中舍曲林与氯氮平的浓度Δ

刘伟忠，陈清霞，温预关，王广发（.广州市脑科医院国家药品临床研究基地，广州50370；.中山大学附属第二医院药学部，广州 500；3.南方医科大学药学院，广州 5050）

舍曲林（Sertraline）是一种选择性的5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂（SSRI），该药通过对突触前膜5-HT再摄取泵的强力抑制，促进5-HT能神经递质的传递；与传统的三环类抗抑郁药不同，舍曲林在中枢的作用部位具有高度选择性，对中枢的各种受体如乙酰胆碱受体、肾上腺素受体、组胺H受体均无阻滞作用，常用于强迫症与抑郁症的治疗[1]。氯氮平（Clozapine）是一种非经典抗精神病药，其镇静作用强，具有强大的抗精神病效应；对精神病阳性和阴性症状均有良好疗效，较少引起锥体外系反应（EPS）[2]。临床上，舍曲林与氯氮平常联合用于抑郁症、强迫症及精神分裂症阴性症状的治疗[3～5]，特别对伴有阴性精神分裂的抑郁症患者疗效显著。这是因为精神分裂症阳性症状与中脑边缘系统多巴胺（DA）活性增强有关，而阴性症状与额前叶DA活性下降及5-HT机制有关。氯氮平具有拮抗5-HT受体作用，从而增强额叶皮质及纹状体DA活性，改善精神分裂症阴性症状；而舍曲林是SSRI类药中已知对细胞色素氧化酶影响最小的药物之一，药物相互作用很少，安全性高，是唯一对DA再摄取产生显著的抑制作用而增强大脑额叶皮质DA功能的药物，具有抗焦虑、抗抑郁双重作用，能增加患者的思维活性，可改善精神分裂症患者的认知功能，从而缓解阴性症状[5]。这2种药物血药浓度的单独测定国内、外均有报道[6～8]，但这些方法仪器成本太高，临床普及受到限制。本试验以建立了一种简单、快速的高效液相色谱（HPLC）法，同时测定人血浆中舍曲林与氯氮平的浓度。

1 材料

1.1 仪器

1100 HPLC仪，包括G1322A在线脱气机、G1315B二极管阵列紫外检测器（DAD）、G1313A自动进样器、G1311A自动调配器、G1316A可调柱温恒温箱和Agilent色谱化学工作站（美国Agilent公司）；XW-80A涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）；BSA124S-CW电子分析天平（瑞士Sartorius公司）；MIKO12-24高速离心机（美国Hettich公司）；MILLI-Q超纯水仪（法国Millipore公司）。

1.2 试药

舍曲林对照品（辉瑞制药有限公司，批号:95872017，含量＞99%）；氯氮平对照品（广东彼迪药业有限公司，批号:20100306，含量＞99%）；内标:地西泮（广东省药品检验所，批号:20060508，含量＞99%）；醋酸铵（广东台山粤侨试剂有限公司，批号:20090125，含量＞98%）；提取剂:乙酸乙酯与二氯甲烷（广州化学试剂厂，含量＞99%）；乙腈与甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:美国迪马公司的DiamonsilTMC18反相柱（150 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相:30 mmol·L－1醋酸铵-乙腈（22∶78）；流速:1.0 mL·min－1；柱温:40 ℃；检测波长:210 nm；灵敏度为0.01 AUFS。

2.2 血浆样品处理

取1.0 mL含舍曲林与氯氮平的血浆至10 mL具塞玻璃锥形离心管内，精确加入1.0 mg·L－1内标液20µL，振荡数秒。再加提取剂乙酸乙酯-二氯甲烷（80∶20）4.0 mL，密塞，涡旋振荡3 min，于6 000 r·min－1的离心机内离心4 min。吸取上清液至5 mL具塞玻璃锥形离心管中，然后置于真空干燥箱内，40℃干燥至干。进样前加甲醇100µL快速振荡数秒溶解残渣，吸取15µL进样。

2.3 色谱分离情况

在本试验条件下，空白血浆、舍曲林与氯氮平对照品+空白血浆+内标以及精神病患者同服舍曲林与氯氮平后的血浆样品，经本法测定，得到的色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

由图1可知，内标物、舍曲林和氯氮平的色谱峰能完全分离，无明显的内生杂质峰干扰，可见本方法具有较高的专属性。内标物、氯氮平和舍曲林保留时间为4.46、5.03和5.84 min。

2.4 标准曲线的制备

在7个10 mL具塞锥形离心管中分别加入不同浓度、相同体积（20µL）的舍曲林与氯氮平对照品溶液，真空抽干溶剂后，再加空白血浆1.0 mL，振荡数秒，使舍曲林血浆浓度分别相当于20.0、40.0、80.0、160.0、240.0、480.0、600.0 µg·L－1，氯氮平血浆浓度分别相当于 50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1 000.0 µg·L－1，然后按“2.2”项下方法处理后，经HPLC分析，测得药物峰面积Ai、内标峰面积As，以Ai/As的值（X）为横坐标，以血浆样品所对应各点药物浓度（Y）为纵坐标绘制标准曲线。经加权（权重W＝1/X2）最小二乘法进行线性回归，分别得舍曲林、氯氮平曲线方程为:Y＝72.527X+1.39（r＝0.998 6）、Y＝43.758X+2.35（r＝0.999 3）。结果表明，舍曲林、氯氮平血药浓度分别在20.0～600.0 µg·L－1、50.0～1000.0 µg·L－1范围内线性关系良好。当信躁比（S/N）＝3时，舍曲林与氯氮平的检测限可达到10.0 µg·L－1。

2.5 回收率及精密度试验[10]

按“2.4”项下方法取舍曲林低、中、高浓度（40.0、160.0、480.0 µg·L－1）和氯氮平低、中、高浓度（100.0、400.0、800.0 µg·L－1）含药血浆样品，按“2.2”项下方法处理，经色谱分析，以峰面积比较，计算回收率:舍曲林与氯氮平低、中、高浓度的峰面积与标准曲线所对应点的峰面积之比为相对回收率；而与相同浓度未经提取获得的色谱峰面积之比为提取回收率。结果显示，相对回收率均＞95%，提取回收率均＞70%。同时，在同日内重复5次和1周内重复5次测定其浓度，计算日内、日间RSD，结果表明，该方法符合生物样品分析要求。回收率及精密度试验结果见表1。

表1 回收率及精密度试验结果（±s ）Tab 1 Results of recovery and precision test（s±s ）

表1 回收率及精密度试验结果（±s ）Tab 1 Results of recovery and precision test（s±s ）

药物舍曲林氯氮平加入量/μg·L-1 40.0 160.0 480.0 100.0 400.0 800.0日内精密度（n＝5）实测浓度/μg·L-1 40.3 158.2 476.3 101.3 397.4 796.6 RSD/%7.63 6.21 5.78 7.41 6.85 4.47日间精密度（n＝5）实测浓度/μg·L-1 40.6 157.8 476.7 100.7 396.1794.6 RSD/%9.52 7.37 5.52 8.14 7.76 5.85相对回收率（n＝5）回收率/%100.30 97.49 96.95 101.50 98.16 97.74 RSD/%7.32 6.71 5.26 7.59 6.36 4.92提取回收率（n＝5）回收率/%75.12 73.75 71.65 77.56 74.35 72.19 RSD/%7.12 6.87 4.31 7.65 5.72 4.46

2.6 样品稳定性试验

按“2.4”项下方法分别配制舍曲林低、中、高浓度（40.0、160.0、480.0 µg·L－1）和氯氮平低、中、高浓度（100.0、400.0、800.0µg·L－1）的3组18个样品（双样），各于室温（25～28℃）放置0、12 h和－20℃冻存1、14 d以及－20℃冻存1、3周后分别进行色谱测定。结果显示，RSD均＜10%，冻存样品未发生药物降解。

2.7 样品的质量控制

按“2.4”项下方法分别配制舍曲林低、中、高浓度（40.0、160.0、480.0 µg·L－1）和氯氮平低、中、高浓度（100.0、400.0、800.0 µg·L－1）36个血浆样品，置于－20 ℃冰箱冻存备用，作为质控样品。每次检测血样时，同时检测质控样品，如果相对回收率均落在85%～115%（低浓度在80%～120%）之内，即可认为仪器检测正常，否则须检查整个操作过程及仪器原因。

3 讨论

舍曲林与氯氮平结构中都有苯环，紫外吸收明显。吸取舍曲林与氯氮平对照品溶液在190～400 nm波长范围内进行紫外扫描，发现舍曲林在210 nm波长处有一最大吸收峰，氯氮平在210、229、256 nm波长处均有最大吸收峰，因此本试验选择210 nm为检测波长。舍曲林与氯氮平血药浓度单独检测方法国内、外已有报道[6～9]，相比之下，本试验采用HPLC法同时测定人血浆中舍曲林与氯氮平浓度的方法，具有操作简单、成本低廉、专属性好等特点，提取回收率＞70%，相对回收率接近100%，日内、日间RSD均＜10%，符合临床药动学试验指导原则关于生物样品分析方法的基本要求，结果可靠。

在本试验的过程中，曾用30 mmol·L－1醋酸铵-甲醇（24∶76）作流动相，也能使内标物和舍曲林、氯氮平有较好分离，但血浆中内源性物质干扰严重，很易引起基线漂移；后改用30 mmol·L－1醋酸铵-乙腈（22∶78）时，色谱峰很理想。另外在本试验过程中曾分别使用乙醚、正己烷、乙酸乙酯和三氯甲烷为提取剂，提取率都达不到要求，而且单采用乙酸乙酯提取时血浆容易出现乳化现象。后改用乙酸乙酯-二氯甲烷（80∶20）作提取剂，提取率较理想，且避免了血浆乳化；采用此混合提取剂一次提取，后用甲醇定容进行紫外色谱分析，所取血浆仅为1.0 mL，进样量15µL便达到试验要求，既提高了灵敏度又减少了样品杂质，保证色谱柱能进行大量样品的连续分析。

在临床精神科，对于难治性精神分裂症或情感障碍，单一用药往往很难控制患者症状，而采用联合用药，治疗效果显著。由于抗精神病药治疗窗相对较窄，毒副作用大，因此对其进行治疗药物监测（TDM），寻找疗效最佳、副反应最轻的适宜血药浓度，具有积极的临床意义。同时，虽然氯氮平血药浓度与患者临床用药剂量呈显著正相关，但从病例资料看也存在一定程度上的个体差异，单一患者的治疗剂量不一定适用于所有患者，应密切监控其血药浓度，做到用药剂量个体化[2]。舍曲林与氯氮平单个药物的TDM国内、外已有报道[6～9]，相比之下，本试验建立的同时测定2种药物的HPLC法，并应用于临床监测，实用性更优越。

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