壳聚糖生物性能及用于细菌性阴道病的探索与研究

崔惠素，石 巍

天津市医疗器械技术审评中心，天津市，300191

壳聚糖生物性能及用于细菌性阴道病的探索与研究

【作 者】崔惠素，石 巍

天津市医疗器械技术审评中心，天津市，300191

目的 通过对壳聚糖抑菌性、生物相容性以及对细菌性阴道病的临床研究，探讨壳聚糖对妇科细菌感染性疾病的疗效。方法壳聚糖对白色念珠菌（ATCC 10231）、大肠杆菌（ATCC 25922）、金色葡萄球菌（ATCC 6538）进行抑菌试验。壳聚糖对雌性白兔进行阴道刺激试验和致敏试验。临床试验将壳聚糖均匀涂覆在细菌性阴道病患者阴道内，每天一次，8天为一个疗程，共20例，观察疗效。结果 壳聚糖凝胶对白色念珠菌的抑菌率≥98%，对大肠杆菌的抑菌率≥99%，对金色葡萄球菌的抑菌率≥99%。与阴道粘膜的生物相容性中细胞毒性为1级，无致敏反应，呈极轻微阴道粘膜刺激。对细菌性阴道病的总有效率为90%、愈显率为75%。

壳聚糖；抑菌；生物相容性

0 引言

甲壳素(chitin)又名甲壳质、几丁质，化学名称为（1，4）-2-乙酰-2-脱氧-β-D-葡萄糖，广泛存在于海洋中甲壳动物的甲壳中，是自然界唯一一种带阳离子的氨基多糖，因其从甲壳动物的甲壳中提取，所以具有良好的生物相容性和生物降解性。壳聚糖（Chitosan）的分子式为(C6H11NO4)n，是通过甲壳素脱去乙酰基而获得的，是一种由氨基葡萄糖和乙酰基葡萄糖通过β-1，4键连接而成的聚合糖。壳聚糖与甲壳素一样具有良好的生物安全性，同时还具有较好的抑菌性能，目前已在医药、食品等领域广泛应用。在医疗器械行业中，壳聚糖产品多用于妇科抗菌膜，手术防粘连膜等。近年来，研究表明分子量的大小和脱乙酰度的高低等指标对壳聚糖抗菌性能影响较大。壳聚糖分子量大小的不同，抑菌机制也可能不尽相同。本论文研究了分子量为100000D-150000D、脱乙酰度≥92.5%、灰分≤1.0%的壳聚糖，对白色念珠菌、大肠杆菌、金色葡萄球菌的抑菌性能，与阴道粘膜生物相容性，及其对细菌性阴道病的疗效。

1 抑菌试验

1.1 材料和方法

1.1.1 材料 壳聚糖溶液的分子量为100 000D-150 000D、脱乙酰度≥92.5%、灰分≤1.0%、无菌(以下简称试验壳浆糖溶液)。

1.1.2 菌株 实验室用菌株分别为白色念珠菌（ATCC 10231）、大肠杆菌（ATCC 25922）、金色葡萄球菌（ATCC 6538）。

1.1.3 培养基 白色念珠菌使用沙式琼脂培养基，大肠杆菌和金色葡萄球菌使用营养琼脂培养基。

1.1.4 菌液制备 取菌株第3～14代的沙式琼脂培养基或营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18～24 h），用5 ml的0.3 mol/l的磷酸盐缓冲液（PBS）洗下菌苔，使菌悬浮均匀后用上述磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至所需浓度。

1.1.5 试验方法 将试验菌24 h斜面培养物用磷酸盐缓冲液(PBS)洗下，制成菌悬液(浓度为：100 μl 滴于5 ml样液内，回收菌数为1×104～9×104cfu/ml)。

被试样液取5 ml的壳聚糖，对照样液取经灭菌处理后的蒸馏水，各4管。

取菌悬液分别在每份样液内滴加100 μl，均匀混合，开始计时，作用2、5、10、20 min，用无菌加样器分别将样液（0.5 ml）加入含5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中2～3个稀释度，分别吸取0.5 ml，置于两个平皿中，用凉至40℃～45oC的营养琼脂培养基（金色葡萄球菌和大肠杆菌）或沙式琼脂培养基（白色念珠菌）15ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35℃±2oC培养48 h（金色葡萄球菌和大肠杆菌）或72 h（白色念珠菌），作活菌菌落计数。

试验重复3次，按下式计算抑菌率：

X4=(A-B)/A×100%

式中：X4—抑菌率，%

A—对照样品平均菌落数

B—被试样品平均菌落数

1.1.6 评价标准 抑菌率≥50%～90%，产品有抑菌作用，抑菌率≥90%，产品有较强抑菌作用。

1.1.7 试验结果 抑菌试验表明壳聚糖对白色念珠菌的抑菌率≥98%，对大肠杆菌的抑菌率≥99%，对金色葡萄球菌的抑菌率≥99%。

2 与人体粘膜的生物相容性试验

2.1 细胞毒性试验

2.1.1 材料 试验壳聚糖溶液。

2.1.2 细胞系 L-929细胞系

2.1.3 培养基 RPMI1640基础培养基

2.1.4 细胞原种培养制备 取出适量的细胞，用机械分散法制成细胞悬浮液。

2.1.5 试验方法 使用直接接触法进行试验。从持续均匀搅拌的细胞悬浮液中提取等量的悬浮液，加于每只试验器皿内，轻轻转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。选择含5%CO2的空气作为缓冲系统，在37oC±2oC下进行培养，直至细胞生长至接近汇合。将壳聚糖轻轻涂覆在每只器皿中央部位，确保其覆盖细胞层表面的十分之一，然后选择含5%CO2的空气作为缓冲系统，在37oC±2oC下进行培养，直至细胞生长至接近汇合。

2.1.6 评价方法 用显微镜检查细胞，评价细胞的一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性。

2.1.7 评价等级 无细胞毒性、轻度细胞毒性、中度细胞毒性、重度细胞毒性。

2.1.8 试验结果 通过镜检观察，细胞一般形态较好，无空泡形成、脱落、细胞溶解等现象，膜完整性良好，故判定为壳聚糖具有轻微细胞毒性。

2.2 阴道刺激试验

2.2.1 材料 试验壳聚糖溶液。

2.2.2 对照材料 选用生理盐水作为对照材料。

2.2.3 试验动物的选择 6只体重大于2 kg同一品种的成年健康雌性白兔。3只为实验组，另外3只为对照组。

2.2.4 试验方法 将白兔固定，提起白兔尾巴使其阴道口完全暴露，使用容量大于1 ml的无菌注射器，将1 ml的试验材料和对照材料分别注入试验组和对照组白兔的阴道内，用无菌脱脂纱布轻轻擦去溢出液体，每隔24 h重复上述试验步骤，连续试验10d。

2.2.5 评价方法 无痛处死白兔后，取下阴道组织，从上皮、白细胞浸润、血管充血、水肿四方面进行组织学评价，并按表1分别对试验组和对照组打分。

分别计算出试验组和对照组总平均分，然后用试验组总评均分减去对照组总平均分得出评价分数，按表2进行评价。

2.2.6 试验结果 试验组白兔上皮存在细胞变性情况，白细胞浸润少于25，存在极少血管充血和水肿情况；对照组动物上皮组织正常，无白细胞浸润，存在极少血管充血和水肿情况；阴道刺激试验得分为3分，表明壳聚糖对阴道存在极轻微刺激。

2.3 致敏试验

2.3.1 材料 试验壳聚糖溶液，对照材料选用生理盐水。

2.3.2 皮内注射溶液 A点：弗氏完全佐剂与生理盐水按50:50的体积比配置成的乳化剂；B点：试验组选用选定的壳聚糖溶液，对照组选用生理盐水；C点：试验组选用选定的壳聚糖溶液、弗氏完全佐剂50:50的体积比共同配置成的稳定溶液；对照组选用弗氏完全佐剂与生理盐水按50:50的体积比配置成的乳化剂。

2.3.3 试验动物的选择 选择10只体重在300 g～500 g的成年、健康白化豚鼠，5只为试验组，5只为对照组。

2.3.4 试验方法 分别在图1所示注射点中注射1 ml相应皮内注射溶液。7 d后，试验组用8 cm2的无菌脱脂纱布浸透所选壳聚糖溶液，覆盖注射点；对照组用8 cm2的无菌脱脂纱布浸透生理盐水，覆盖注射点，封闭包扎固定，48 h后去除。14 d后，试验组采用浸透皮内注射C点浓度的壳聚糖乳化液的无菌脱脂纱布覆盖注射点并固定，对照组选用浸透皮内注射C点浓度的生理盐水乳化液的无菌脱脂纱布覆盖注射点并固定，24 h后去除。

观察情况 分数1、上皮正常细胞变性或变扁平组织变形局部糜烂广泛糜烂2、白细胞浸润无少于2 5 2 6～5 0 5 1～1 0 0大于1 0 0 3、血管充血无极少轻度中度重度伴随血管破裂4、水肿无极少轻度中度重度0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

表2 阴道刺激评价表Tab.2 Evaluation list of vaginal irritation experimentation

图1 试验注射点示意图Fig.1 Diagram of injection point of trial

2.3.5 评价方法

去除敷贴48 h后，在自然光条件下观察豚鼠试验皮肤变化，如无明显变化记0分，出现点状红斑记1分，融合性红斑记2分，重度红斑伴随水肿记3分。若试验组各试验部位记分高于对照组中最严重记分，则判定壳聚糖具有致敏性。

2.3.6 试验结果

通过试验观察，未出现试验组记分高于对照组最严重记分情况，表明壳聚糖产品不会产生致敏反应。

3 细菌性阴道病疗效观察

3.1 材料试验壳聚糖溶液。

3.2 病例选择

选择20例年龄在18～50岁确诊为细菌性阴道病的女性患者作为受试对象，同时应剔除合并其它外阴、阴道炎患者和过敏体质者。

3.3 试验方法

试验前按表3对受试者进行评价，确定患病程度。患者月经期后3 d，开始使用无菌注射器，每晚在患者阴道均匀内注射2.5 ml壳聚糖溶液，持续8天，停止注射后观察14 d，试验期间禁止患者盆浴和性生活。

3.4 评价标准

疗效评价记分表，如表3所示。上述三项总平均分为0时，表明患者无细菌性阴道病，总平均分为0～1（包含1）时表明患者呈轻度细菌性阴道病，总平均分为1～2（包含2）时表明患者呈中度细菌性阴道病，总平均分为2～3时表明患者呈重度细菌性阴道病。

3.5 疗效评定

痊愈 试验后总平均分为0。

显效 试验后评价结果比试验前评价结果降低一个档次以上，如：试验前评价为重度，试验后评价为轻度，若试验后记分为0，则按痊愈统计。

有效 试验后总平均分相对试验前总平均分有所减少。

无效 试验后总平均分相对试验前总平均分未减少或增加。

3.6 试验结果

20名受试者中试验前轻度患者4名，中度患者9名，重度患者7名。其中由轻度转为痊愈者1名，严重度降低等级患者14名，总平均分降低患者3名，未见效果患者2名。愈显率为75%，有效率为90%。

Research of Bio-performance of Chitosan and Chitosan Being Used for Bacterial Vaginopathy

【Writers】Cui Huisu, Shi Wei

Tianjin Center of Medical Device Evaluation, 300191

Objective Discussing the chitosan’ medical ef fi ciency to treat Gynecology bacteria infectious disease by researching the bacteriostasis, biocompatibility of chitosan and analyzing the chitosan’ medical ef fi ciency to Bacterial vaginosis by clinical examination. Methods The antibiotic experiment of chitosan to Candida albicans (ATCC 10231), Escherichia Coli (ATCC 25922) and Golden staphylococcus (ATCC 6538) has been studied in this paper. The vaginal irritation experimentation of chitosan to female rabbit and the sensitization experimentation of chitosan to guinea pig also have been conducted. To study the curative effect, we also coat a layer of chitosan in 20 patients’ vagina. Result The Antibacterial rate of chitosan to Candida albicans is more than 98% and to Escherichia Coli is more than 99% and to Golden staphylococcus is more than 99%. Cytotoxicity of chitosan to vagina mucosa is grade 1 and sensitization of chitosan to vagina mucosa is none and stimulation of chitosan to vagina mucosa is very slightly. The total ef fi ciency rate to treat Gynecology bacteria infectious disease is 90% and the cure rate is 75%.

chitosan, bacteriostat, biocompatibility

R318.08

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2012.02.005

1671-7104(2012)02-0096-03

2011-12-13

崔惠素，E-mail:cuihuisu@sina.com