Ang-2和HIF-1α在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义

李启虎 王学华

1.四川省长宁县中医院，四川长宁 644300；2.四川省宜宾市第一人民医院泌尿外科，四川宜宾 644000

近年来，我国泌尿科临床最常见的肿瘤是膀胱肿瘤。其中，有约90%的膀胱恶行肿瘤是膀胱移行细胞癌[1]。国内外近期的研究证实供应肿瘤的营养物质依赖于肿瘤血管，影响肿瘤的生长、浸润和转移。近年来研究的重点和热点主要围绕和侧重于肿瘤血管的形成机制及抗肿瘤血管形成两方面[2-3]。

本实验通过探讨血管生成素-2（Ang-2）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在膀胱移行细胞癌中的表达及其与膀胱移行细胞癌病理分级、临床分期之间表达和相互关系，对实验数据进行统计学处理，探讨两者在膀胱移行细胞癌中表达的相互关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取经60例膀胱移行细胞癌患者，均经临床病理诊断确诊，男51例，女9例，年龄33～81岁，平均（60.1±3.6）岁。所有试验样本均经过手术切除，石蜡包埋细胞癌标本并存档。其中，进行尿道膀胱肿瘤电切33例，膀胱部分切除17例，根治性全膀胱切除10例。20例患者取前列腺摘除术切除的多余正常膀胱黏膜。对实验样本编号并做连续切片，每个样本切片厚度4 cm，每个样品切5片，一张用作HE染色，一张用作阴性对照，两张用于Ang-2和HIF-1α的检测，剩余一张备用。各实验样本切片经常规常规HE染色后进行组织学观察。病理分级根据WHO标准进行分为三级，Ⅰ级21例，Ⅱ级22例，Ⅲ级17例；临床分期按UICC分期标准[4]，浅表型（Tis-T1期）43例，Ta 5例，T1 38例；17例浸润型（T2-T4期），T2 11例，T3 5例，T4 1例。

1.2 实验步骤与试剂

将石蜡切片脱蜡至水，按照试剂盒说明书采用免疫组化染色S-P法测定，Ang-2和 HIF-1α一抗工作浓度均为1∶100，最后脱水，透明，中性树胶封固，显微镜观察。Ang-2阳性结果显微观察中，400倍的高倍镜下选择4个强免疫反应视野观察并计数肿瘤细胞，计数量≥800个。HIF-1α阳性结果显微观察中，高倍镜下随机抽取5个视野对肿瘤细胞观察，并计数。计数量200个。

一抗：Ang-2（武汉博士德生物工程有限公司，BA1530）；HIF-1α多克隆兔抗人抗体（武汉博士德生物工程有限公司，BA0912）；即用型超敏S-P试剂盒（鼠兔通用型）（福州迈新生物技术有限公司产品，KIT-9710），DAB（福州迈新生物技术有限公司产品，DAB-0031）；柠檬酸抗原修复缓冲液（福州迈新生物技术有限公司产品，MVS-0066）。

1.3 结果判断标准

1.3.1 Ang-2阳性结果判断标准 细胞浆和胞膜中分布着以棕黄色颗粒状或线网状为主的Ang-2阳性染色体，结果判断参照文献[4]。根据细胞的染色程度和比率将计数细胞分为4个级别：无阳性细胞为阴性（-）；20%阳性细胞并微弱染色为弱阳性（+）；20%～50%阳性细胞并中度染色为中度阳性（++）；＞50%阳性细胞并强染色为强阳性（+++）。阳性表达判定：中度阳性（++）和强阳性（+++），阴性表达判定：阴性（-）和弱阳性（+）。见图1。

1.3.2 HIF-1α阳性结果判断标准 细胞核和（或）胞浆中分布着以棕黄色颗粒状为主的HIF-1α阳性染色体。结果判断参照文献[5]。按细胞染色强度和比率分为5个级别：（-）肿瘤细胞无着色；（±）＜10%的细胞染色；（+）11%～25%的细胞染色；（++）26%～50%的细胞染色；（+++）51%的细胞染色。阳性表达判定：中度阳性（++）和强阳性（+++），阴性表达判定：阴性（-）和弱阳性（+）。见图2。

图1 TCCⅡ级组织中Ang-2（+），阳性物质位于肿瘤细胞胞浆胞膜，呈棕黄色（SP×400）

图2 TCCⅡ级组织中HIF-1α（+），阳性物质主要位于肿瘤细胞核，呈棕黄色（SP×400）

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件对实验结果数据进行处理分析,计数资料采用x2检验和Spear-man等级相关分析检验。检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ang-2阳性表达与膀胱移行细胞癌病理分级的关系

本研究中Ang-2和HIF-1α在正常膀胱组织中无表达，但在膀胱移行细胞癌标本均有表达，Ang-2和HIF-1α在膀胱移行细胞癌中的阳性表达率分别为47.7%（28/60）、41.7%（25/60）。Ang-2和HIF-1α在膀胱移行细胞癌中阳性表达率随其病理分级和临床分期增加而升高。见表1。

表1 Ang-2阳性表达与膀胱移行细胞癌病理分级的关系

2.2 Ang-2阳性表达与膀胱移行细胞癌临床分期的关系

Ang-2阳性表达率和染色强度与临床分期成正比关系，各期的阳性率经统计学x2检验，差异有统计学意义（P=0.001＜0.05）。见表2。

表2 Ang-2阳性表达与膀胱移行细胞癌临床分期的关系

2.3 HIF-1α阳性表达与膀胱移行细胞癌病理分级的关系

HIF-1α阳性率在膀胱移行细胞癌阳性率逐步升高，表明HIF-1α阳性表达率和染色强度与病理分级成正比关系。见表3。

2.4 HIF-1α阳性表达与膀胱移行细胞癌临床分期的关系

试验中Tis-T1期与T2-T4期的阳性率分别为23.3%、73.7%，两期的阳性率经统计学x2检验，差异有统计学意义（P=0.001＜0.05），HIF-1α阳性率越高膀胱移行细胞癌的浸润越深。见表4。

表3 HIF-1α阳性表达与膀胱移行细胞癌病理分级的关系

表4 HIF-1α阳性表达与膀胱移行细胞癌临床分期的关系

2.5 Ang-2、HIF-1α在膀胱移行细胞癌中的表达情况

经统计检验，Ang-2与HIF-1α的等级相关系数rs为0.498，P＜0.05，差异有统计学意义。见表5。

表5 Ang-2、HIF-1α在膀胱移行细胞癌中的表达情况

3 讨论

有研究认为，正常的膀胱组织中血管稳定，呈静息状态，而肿瘤血管的形成受膀胱移行细胞癌的肿瘤血管不稳定的诱导，而这种不稳定与Ang-2有关[5]，通过抑制Ang-1与Tie2结合使得自身可以与Tie2受体结合。膀胱移行细胞癌浸润的深浅度与Ang-2阳性率有关，阳性率越高浸润越深，表示预后越差，这点在本次通过研究中被证实，Ang-2阳性率在膀胱移行细胞癌G1、G2、G3级中分别为28.6%、54.5%、64.7%，阳性率逐步升高，表明Ang-2阳性表达率和染色强度与病理分级成正比关系，Tis-T1期与T2-T4期的阳性率分别为32.6%、82.4%，两期的阳性率经统计学x2检验， P＜0.05，差异有统计学意义（P=0.001），表明阳性率越高膀胱移行细胞癌的浸润越深。Ang-2参与膀胱移行细胞癌的发生、发展过程，可能通过调节肿瘤血管形成来完成。癌变过程中膀胱组织获得了Ang-2，试验中强阳性染色多分布在高分级（G3）和高分期（≥T2）肿瘤的癌细胞中，另外部分切片可在肿瘤微血管内皮上发现有阳性表达。

有研究表明，HIF-1α在膀胱移行细胞癌中过表达可上调VEGF,日本研究表明，有学者通过建立HIF-1α过表达膀胱移行细胞癌细胞株（EJ-HIF1[alpha] cells）并对其研究后发现，过HIF-1α的过表达加速细胞增殖生长[6-7]。HIF-1α过表达参与膀胱移行细胞癌血管的形成[8-9]，Kondo等[9]研究表明，HIF-1α阳性率与膀胱肿瘤组织中微血管计数（microvessel count，MVC）正相关。本研究通过对HIF-1α与膀胱移行细胞癌临床病理特征两者之间关系进行分析，HIF-1α过表达可能通过提高肿瘤血管形成而促进膀胱移行细胞癌的生长，HIF-1α阳性率在膀胱移行细胞癌G1、G2、 G3级中分别为23.8%、40.9%、64.7%，阳性率逐步升高，表明HIF-1α阳性表达率和染色强度与病理分级成正比关系，本研究中G1与G3阳性率相比较，经x2检验，差异有统计学意义（P=0.016＜0.05）也证实这一结论。试验中Tis-T1期与T2-T4期的阳性率分别为23.3%、73.7%，两期的阳性率经统计学x2检验，差异有统计学意义（P=0.001＜0.05），HIF-1α阳性率越高膀胱移行细胞癌的浸润越深。本研究结果表明，膀胱移行细胞癌的恶性程度及浸润程度与HIF-1α有关，其阳性表达率、染色强度与病理分级和临床分期成比例关系。在整个癌变过程中膀胱组织有基因突变发生，还发现在肿瘤血管上皮细胞核上有许多标本切片中的HIF-1α呈现强染色并参与膀胱移行细胞癌的缺氧调节。

本实验通过探讨血管生成素-2和缺氧诱导因子-1α在膀胱移行细胞癌中的表达及其与膀胱移行细胞癌病理分级、临床分期之间表达和相互关系，有研究认为Ang-2和 HIF-1α的阳性率表达之间有正向相关，统计学分析实验的研究结果表明，Ang-2和HIF-1α在膀胱移行细胞癌中表达，rs（Ang-2，HIF-1α）=0.498，P＜0.05，差异有统计学意义，其在缺氧这一始动因素作用下相互协同调节VEGF并相互影响，且呈现两两相关的特殊关系，共同参与膀胱移行细胞癌的肿瘤血管形成，进而影响膀胱移行细胞癌的生物学行为。目前尚不清楚其具体作用机制，需要科学工作者及临床医务者们共同继续研究。

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