乌饭树树叶多糖提取及纯化工艺优化研究

程素娇 邓璐璐 章海燕 夏肖肖

张 晖1 钱海峰1 齐希光1 王 立1，2

（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214036；2.生态纺织教育部重点实验室（江南大学），江苏 无锡 214036）

乌饭树是一种药食兼用的传统植物资源，在中国分布广泛。乌 饭 树 树 叶 （Vaccinium Bracteatum Thunb.leave，VBTL）含有多糖、黄酮、花色苷类、多酚类、单宁类等多种有效成分，其提取物具有抗氧化［1］、抗癌防 癌［2］、抑菌［3］、抗疲劳［4］以及保护视网膜免受光损伤［5］等生理功效。国外对乌饭树同属植物研究和开发较早，目前已形成系列化产品如饮料、罐头、果酱、果醋等［6－8］。中国国内对乌饭树同属植物的研究较晚，相关产品开发也不多，高附加值的产品较少。

植物多糖具有如抗肿瘤［9］、免疫调节［10］、抗凝血［11］和降血糖血脂［12］等多种生理功能。据Franz［13］报道植物多糖来源广泛且没有细胞毒性，目前已有近百种植物多糖被提取分离并进行了结构鉴定。本研究小组前期研究［14］发现乌饭树树叶多糖具有改善2型糖尿病小鼠血糖血脂的作用。本试验对乌饭树树叶多糖的提取工艺进行优化，旨为乌饭树资源尤其是乌饭树树叶多糖的开发利用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乌饭树树叶：2011年购于江苏溧阳；

其它常用试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

分光光度计：725型，无锡市科达仪器有限公司；

循环水式真空泵：SHZ－3，上海沪西分析仪器厂；

旋转蒸发仪：RE－52，上海沪西分析仪器厂；

低速自动平衡离心机：L550，湖南湘仪离心机有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 VBTL多糖提取工艺流程

乌饭树树叶干燥粉碎过80目筛→浸提→离心取上清液→旋转蒸发浓缩→乙醇沉淀→离心→沉淀复溶→旋转蒸发浓缩→VBTL多糖

1.2.2 浸提工艺优化 以VBTL 多糖得率为指标，分别考察料液比、提取时间、温度、pH 对提取效果的影响。基本条件：料液比1∶40（m∶V），时间2h，温度60 ℃，pH 为8，改变其中一个条件，固定其它条件分别考察不同的影响因素。本试验各因素水平梯度：料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（m∶V）；提取时间1，2，3，4，5h；提取温度30，40，50，60，70 ℃；pH 值8，9，10，11，12。在单因素试验的基础上，设计响应面试验优化VBTL多糖的提取工艺。

1.2.3 纯化工艺优化 以VBTL 多糖的纯度为指标，分别考察提取液与乙醇的体积比、乙醇体积分数、乙醇静止时间对纯度的影响。

1.2.4 多糖得率以及纯度的计算 采用苯酚硫酸法［15］测总糖含量和直接滴定法测还原糖含量（GB／T 5009.7——2008）。分别按式（1）～（3）计算多糖的含量、得率及纯度。

1.2.5 测总糖标准曲线 以葡萄糖标准品为样品，得到苯酚硫酸法标准曲线为y ＝8.935 7x＋0.001，R2＝0.999 9。

1.2.6 数据分析 用Design－Expert 7.1.6分析软件对数据进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 浸提工艺的单因素试验

2.1.1 料水比对多糖得率的影响 由图1可知，VBTL 多糖得率随料水比的增加而提高。当料水比超过1∶40（m∶V）以后，VBTL多糖的得率随着料水比增加上升趋势渐近平缓，原因可能是在未达到扩散平衡时，随溶剂量的增加，多糖被提取出来的量就越多，当扩散达平衡时，溶剂量不再显著影响多糖得率。这与张耀光等［17］在提取甘草多糖工艺中的研究结果相似。综合考虑经济因素，选择料水比为1∶40（m∶V）。

2.1.2 提取时间对多糖得率的影响 由图2可知，随着提取时间的增加，VBTL多糖呈现以3h为顶峰的趋势。这与钟方丽等［18］在提取刺玫果糖工艺研究中的结果相似。当提取3h时，得率达到最大值，说明此时糖在固液之间的传质基本达到了动态平衡，因此，提取时间选择为3h。

图1 料水比对VBTL多糖得率的影响Figure 1 Effect of liquid－soild ratio on the yield of polysaccharides from VBTL

图2 提取时间对VBTL多糖得率的影响Figure 2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from VBTL

图3 温度对VBTL多糖得率的影响Figure 3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from VBTL

2.1.3 温度对多糖得率的影响 由图3可知，在30～60 ℃时，VBTL多糖得率随着温度提高而提高；在60～70 ℃时，随着提取温度的提高，VBTL多糖得率反而有所下降。张彬等［19］研究开发的茶多糖提取工艺也得到了相似的结果，推测原因可能是温度升高时，溶剂的渗透能力和溶解能力有所提高，加速了细胞内多糖的浸出，但是过高的温度可能改变糖的结构，使其丧失活性。综合考虑工艺可行性和多糖活性，选提取温度为60 ℃。

2.1.4 pH 值对多糖得率的影响 由图4可知，随着pH 的升高，VBTL多糖得率呈现以pH 9为分界点的峰型变化趋势。这与刘永录等［20］研究的pH 对黄氏多糖收率影响的结果一致。推测原因［20］为碱能减弱细胞壁聚合物分子间的物理和化学作用，有利于多糖的浸出，提高其得率，但碱浓度过高，会使VBTL中的杂质浸出，得率反而下降。因此溶液pH应选择9为宜。

图4 溶液pH 对VBTL多糖得率的影响Figure 4 Effect of pH on the yield of polysaccharides from VBTL

2.2 VBTL多糖提取工艺Box－Behnken中心设计及响应面法优化

根据单因素试验结果，以料水比、温度、时间和pH 为因素，设计了一个四因素三水平中心组合设计，试验因素水平设计及结果见表1、表2。

表1 Box－Behnken设计试验因素水平及其编码表Table 1 Box－Behnken design test factors and coding table

2.2.1 不同因素对VBTL多糖得率的影响 对表2进行分析，得到如下回归方程：

对回归模型进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，误差项不显著，回归模型显著（α＜0.05），回归模型的决定系数（R2）为0.869 7，表明回归方程与实际情况吻合度高，认为可以用该回归方程来分析试验结果。从表3分析得到各因素的影响顺序为提取温度＞料水比＞pH值＞提取时间。另外也可以看出各因素对响应值的影响不是线性关系。

2.2.2 因素之间的交互作用影响 由表3可知，X1和X4为非常显著项，将各项分析比较，结果见图5～10。

由图5～10可知，固液比和提取温度之间的交互作用对VBTL多糖得率的影响较大。

表2 Box－Behnken试验结果Table 2 Box－Behnken design test results

2.2.3 寻取最优值 根据软件预测的Y 的最大估计值为69.4544mg／g，对应条件为提取温度65 ℃，提取时间2.5h，pH 值9.5，固液比1∶45（m∶V）。此条件下验证实验结果为68.6291mg／g（n＝3），说明RSM 可用于优化提取工艺条件，且结果与实际值接近。

2.3 VBTL多糖的纯化工艺优化

由于以上结果得出VBTL多糖的纯度仅为38.27%，因此本试验对VBTL多糖的纯化进行了研究。选取提取液与乙醇的体积比、乙醇体积分数、乙醇静止时间为因素设计三因素三水平的正交试验L9（34），对VBTL 多糖纯化工艺进行优化，因素水平见表4，正交试验结果见表5。

表3 方差分析表Table 3 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model

图5 提取时间与提取温度交互作用Figure 5 Response surface of Interaction effect of extraction time and temperature

以VBTL多糖纯度为考察指标，由表5可知，各因素对VBTL多糖含量的影响顺序为B＞C＞A，且VBTL 多糖纯化最佳工艺为A2B2C3，即：乙醇静止时间为6h，乙醇体积分数为95%，提取液与乙醇体积比为1∶5。经验证实验，平均VBTL多糖纯度为52.03%（n＝3）。

图6 溶液pH 与提取温度交互作用Figure 6 Response surface of interaction effect of extraction pH and temperature

图7 固液比与提取温度交互作用Figure 7 Response surface of interaction effect of solid－liquid and extraction temperature

图8 溶液pH 与提取时间交互作用Figure 8 Response surface of Interaction effect of extraction pH and time

3 结论

图9 料水比与提取时间交互作用Figure 9 Response surface of interaction effect of solid－liquid and extraction time

图10 固液比与溶液pH 交互作用Figure 10 Response surface of interaction effect of solid－liquid and extraction pH

表4 因素水平表Table 4 The table of factors and levels

本试验采用Box－Behnken 响应面试验设计法优化了VBTL 多糖的提取工艺，确定了最佳提取工艺：1∶45（m∶V）的料水比，调pH 到9.5，在65℃下提取2.5h，多糖得率为68.629 1mg／g，纯度为38.27%，与预期模型所得数值接近，可以为乌饭树树叶多糖提取提供预测和理论基础。同时采用正交试验L9（34）优化得到多糖纯化工艺：提取液与95%乙醇按1∶5（V∶V）混合，静置6h，多糖纯度提高到52.03%，试验结果可为VBTL 多糖的加工生产提供技术参考。

但本试验所得VBTL多糖的纯度不高，如需进一步纯化可采用凝胶色谱法和离子交换色谱等技术。

表5 正交试验结果Table 5 Results of orthogonal experiment

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