微生物胞外聚合物的研究进展

皋德祥，邓欢欢，张明华，3，葛利云，王红武

（1.温州医学院 水域科学与环境生态研究所，浙江 温州 325035；2.同济大学 环境科学与工程学院，上海 200092；3.University of California，Land，Air and Water Resources Department，Davis，CA 95616)

微生物胞外聚合物的研究进展

皋德祥1，邓欢欢1，张明华1，3，葛利云1，王红武2

（1.温州医学院 水域科学与环境生态研究所，浙江 温州 325035；2.同济大学 环境科学与工程学院，上海 200092；3.University of California，Land，Air and Water Resources Department，Davis，CA 95616)

微生物；胞外聚合物；特性；提取方法；组成；综述文献

胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）是一类有机高分子多聚化合物，相对分子量分布在1×104～3×104之间，它是在特定的生存条件下微生物新陈代谢过程中产生的胞外物质。这类物质可以起到对微生物自身的保护和它们之间相互附着的作用，而且在微生物缺乏营养的条件下可以为其提供营养来源[1]。EPS在微生物群体中广泛存在，EPS有一些独特的性能，使EPS的研究越来越受到人们的重视。

国内外研究者对EPS开展了大量的研究。本综述对EPS的组成、结构、特性、提取方法、成分分析、仪器分析等进行了概述，并综合介绍了其在实际工程中的应用范围、现有发展及今后的研究趋势，为EPS今后更深入的分析研究提供基础资料。

1 EPS的概述

1.1 EPS的组成 EPS的组成成分比较多样，其组分因其来源微生物的不同也有差异，但总的来说，EPS由蛋白质、多糖、核酸、糖醛酸[2]、脂类、腐殖酸[3]、氨基酸等组成。蛋白质和多糖是其主要成分，占EPS总量的70%～80%[4]。其次，很多的外界因素也会影响EPS各组分的比例，如吴志高[5]研究了增加进水中的碳源含量而氮、磷相对缺乏的情况下对污泥EPS的影响，当比较反应器内BOD5/TP值为100/0这种极限状态和BOD5/TP值为100/1.2的正常状态时发现，前者污泥EPS中各种成分的含量有了不同程度的增大：多糖含量由12.12 mg/gVSS骤升至32.92 mg/gVSS，增幅达172%；蛋白质含量由9.43 mg/gVSS增加13.37 mg/gVSS，增加了42%；DNA含量由5.72 mg/gVSS增加到13.80 mg/gVSS，增加了141%；EPS总量由27.28 mg/gVSS增加到60.09 mg/gVSS，增加了120%。

目前，研究者的研究重点主要集中在EPS中主要成分——多糖类和蛋白质，而对EPS中其他成分的研究和应用相对较少。

1.2 EPS的结构 微生物EPS可分为溶解性EPS（soluble EPS，sEPS）和结合态EPS（bound EPS，bEPS）。sEPS是微生物新陈代谢、自溶等生成的游离态大分子物质[6]。bEPS是具有有流变性的双层结构物质，是由紧密附着的内层（tightly bound EPS，TEPS，TP）和疏松附着的外层（loosely bound EPS，LEPS，LP）组成[7]。

1.3 EPS的特性 EPS有以下一些特性，这些特性是其能被广泛研究应用的重要原因：①表面电负性：EPS一般都是呈电负性，这是因为其组成结构上存在带负电性的基团多于带正电性的基团，这些带电基团的电量其绝对值一般分布于0.2～0.6 meq·g-1MLSS[8]。②吸附性：EPS的吸附性归功于其成分大都是表面积很大的大分子物质，同时这些物质表面也存在多种非极性和极性的官能团，其中多糖类物质在EPS吸附作用中起重要的作用[9]。③絮凝性：EPS的絮凝性主要是其成分的大基团的作用，表现在这些大的官能团在适合的条件下与溶液中悬浮颗粒通过离子键、氢键作用相结合而形成网状结构而沉淀[10]。④亲水疏水性：EPS中的蛋白质、腐殖质、尿酸是疏水性组分，而多糖类则是亲水性的主要成分[11]。EPS的亲水疏水性也受众多条件的影响，龙腾锐等[12]研究发现SRT为15 d的TEPS比较于3 d的TEPS有更强的疏水性。

此外，EPS也能稳定絮凝体的结构，在细胞外形成保护层抵御杀菌剂和有毒物质等的危害，保持细胞水分，富集营养物质等重要的一些生理功能[13-14]。最近也有研究者发现EPS能对防止金属腐蚀起到一定的功效。

2 EPS的提取

微生物EPS不同提取方法的结果对微生物细胞或者EPS的属性表达具有不同的影响[15]，同时也决定了EPS的组分、干重[16]、含量及提取效率等，因此选择合理的提取方法非常重要。

理想的EPS提取方法应该满足以下3个条件：①对EPS的组分功能不会产生破坏或产生的破坏极小；②能够获得纯化效果好的成分；③具有比较高的提取效率[1]。

EPS的提取方法大体上可以分为物理提取法、化学提取法和物理-化学联合提取法三大类。这样的分类方法是基于化学试剂是否在EPS与细胞膜分离的过程中起作用而提出的。

物理提取法的主要原理是利用外加力量来提高EPS中各种成分在液体中的溶解度，常用的有超声波法、超声离心法、蒸汽提取法、常规高速离心提取法、热提取法等[17]。物理提取法具有不添加化学试剂、EPS的生物活性成分破坏小、比较平和的优点，缺点是EPS提取量较少。因此，物理提取方法比较适用于后续实验过程中EPS的光谱、吸附等灵敏度要求高、EPS官能团结构变异小的实验类型，而对于要求提取大量的EPS则不是理想的方法。

化学提取法主要原理是试剂中的离子或分子利用生物膜的内传质作用进入生物膜后试剂与EPS相接触而成为水溶性混合物而达到提取目的，常用的有氢氧化钠提取法、乙醇提取法、乙二胺四乙酸（EDTA）提取法、磷酸缓冲溶液提取法、三羟甲基氨基甲烷/盐酸（Tris/HCl）提取法、阳离子交换树脂提取法（CER）、甲醛-氢氧化钠提取法、戊二醛提取法、硫酸提取法等[18-20]。化学提取法一般具有提取量大的优点，但化学提取法容易造成细胞的死亡破裂，细胞内物质外流而使提取的EPS有胞内杂质，影响提取结果进而影响后续检测结果的准确性[1]。

综合考虑物理提取法和化学提取法的优缺点及实验研究的实际需要，优化和组合成合适的物理-化学联合法不失为一种合适的方法[1]。物理化学法有超声波-阳离子树脂法[15]、超声波-甲醛法[21]等。在实际应用时把两种方法的契合点找好，将会大大提高提取的效果。

目前EPS的提取的微生物对象大体可以认为是生物膜、活性污泥膜和细菌三种类型[22]。

物理法和化学法均适用于生物膜的EPS的提取。目前对生物膜的提取大多采用化学法，不过化学法会破坏细胞而造成核酸含量大增，因此，加入的化学试剂的浓度不能过高。葛利云等[23]通过研究发现活性污泥膜EPS的提取大多是也利用了生物膜的提取原理。常用的活性污泥膜的EPS提取法有：加热提取法、超声波提取法、阳离子交换树脂法，也常用一些组合方法，如甲醛-NaOH法、超声波-阳离子交换树脂法等。

研究者研究从细菌细胞中提取EPS大多数还是采用化学法（如EDTA或甲醛法）和物理法（如超声波或阳离子树脂法）。但在这些方法之中，有人通过仪器分析发现超声波等并不能完全使EPS从细胞表面脱落，而化学试剂又会造成细胞破裂而影响提取结果，因此，阳离子树脂提取法较为合适[24]。除此以外，国内外很多研究都采用一种提取工艺：选择菌种-液体培养基培养-机械离心-药品醇析-低温冻干，这样提取出的EPS有助于对其做更深入的研究。

3 EPS的特性分析

研究者用各种提取方法从微生物中提取EPS后，要对提取出来的EPS的提取效率、提取方法、结构、特性、成功率、EPS的实际应用范围等进行评价，这些评价可以通过对提取出来的EPS进行特性分析得以实现。

3.1 EPS的组成成分分析 EPS主要成分的测量方法将影响提取的EPS含量的评价，其组分的测量常采用分光光度法。分光光度法通常是通过消解样品中的待测成分，将成分变成水解产物后投加显色剂，水解产物与显色剂发生显色反应，根据显色反应的颜色深浅程度来测定样品中成分的含量。不过测定这些物质含量的方式较多，如加何种显色剂、加多少量、用何种波长来监测其显色的程度等。目前尚未有确定的测定标准，不同测定方法对测定结果的影响较大，因此，在研究其成分含量时，一定要结合操作、可靠性、准确性等方面进行综合考虑。

多糖的测定常采用蒽酮比色法[25]、苯酚硫酸比色法[25]、紫外-可见分光光度法[37]等；蛋白质的测定方法通常有凯氏定氮法[25]、双缩脲法[25]、Folin-酚试剂法（Folin-Lowry法）[25]、修正后的Folin-Lowry法[25]、考马斯亮兰法（Bradford法）[25]、紫外吸收法[26]等；核酸（DNA）含量的分析可以采用荧光分析（DAPI法）[25]、定磷法[25]、紫外吸收法[25]、二苯胺比色法[40]；腐殖质的测定目前还是采用修正后的Lowry法[25]居多；糖醛酸的测定方法有间羟基联苯硫磺酸法[25]、硫酸咔唑法[27]。

不同的检测方法适合不同的样品，并且对EPS的提取方法评价及其成分的表达等有不同的影响。Benetti[28]采用葡萄糖作为标准物质，用蒽酮法和硫酸-苯酚比色法分别测量含有50 g的葡聚糖、黄原胶、褐藻酸的样品，结果发现采用蒽酮法比硫酸-苯酚法有更高的检测效果。

3.2 EPS的仪器分析 某些情况下，如观察EPS在细胞外分布、结构、絮凝的效果、电负性、吸附前后形态、酶处理前后形态等性质时，需要通过一些先进仪器方法进行分析。目前国内外对EPS的结构特性、表面形态等分析和研究主要采用三维荧光光谱技术（3DEEM）、扫描电镜（SEM）[29]、傅里叶红外光谱仪（FTIR）、飞行时间质谱（TOFMS）、激光共聚焦显微镜（CLSM）[21]与不同荧光探针联合、能谱仪、核磁共振（NMR）、微相吸附-光谱修正技术（MSASC）-刚果红（Congo Red，CR）探针联合[30]、能谱仪、磁共振（NMR）等先进仪器方法。熊芬等[31]采用阳离子交换树脂法提取烟曲霉EPS，通过FTIR分析表明，多聚糖中的羟基、羧基和C—O—C等官能团是与Pb2+发生作用的基团，而其中蛋白质发生的作用不明显。

4 EPS的实际应用

鉴于微生物EPS众多特性，随着生物技术在各领域的不断发展和应用，EPS在相应的实际工程中已得到了广泛的应用。

4.1 在废水处理方面 目前，EPS在环境工程中的应用主要是体现在去除废水中的重金属方面，EPS在应用的过程中起到了絮凝剂、络合剂等作用。研究者们对于EPS去除废水中金属离子的机制，提出了不同的观点，主要可以归纳为以下几点：①先期沉淀的金属离子被生物膜的絮凝物捕获；②EPS与可溶性金属离子成键；③细胞吸收积累可溶性金属；④使金属通过向大气中挥发而达到去除的效果[32]。

微生物的EPS去除重金属离子具有许多潜在的优点：①在污水中仍然可以有效地去除金属离子。②在低浓度的情况下，少量菌体生物量也能有效地去除金属离子。③微生物的EPS是可利用的天然可再生的生物物质，环保可持续。④具有处理水中多种金属离子的能力，具有多重性[33]。Zhang等[34]通过荧光光谱技术（EEM）发现，微生物EPS中的可溶性有机物对汞（II）有很好的吸附能力。

此外，EPS还能影响污泥的絮凝和沉降起作用，对污泥的吸附性能有影响，也能对生物除磷等方面发挥作用[35]。不过EPS在环境工程水处理方面是造成膜生物反应器（MBR）中膜污染的主要物质，膜的主要污染形式为胞外多糖在膜表面的沉积[36]。但是，通过研究污染机制采用一定的优化措施是可以达到有效防治或减缓EPS对膜污染，从而达到提高膜处理废水的效率。

4.2 在矿物冶金方面 在矿物冶金工程上，很多国内外研究者参考了环境领域有关微生物EPS在处理重金属废水方面的研究机制，在矿物浮选过程中利用了微生物EPS的絮凝性、吸附性等。细菌EPS在键合金属离子方面有选择性，但多数情况下，起关键作用的大分子类型还未确定。研究显示，多糖具有较强的金属固定能力，蛋白质也具有金属离子键合作用[37]。

EPS在矿物冶金中主要有3种作用形式：①帮助加快矿物体在水溶液中溶解；②改变矿物表面化学性质；③吸附冶金废水中的金属离子[18]。

4.3 在医药生物方面 医药生物工程中对EPS的研究和应用主要集中在EPS的主要成分——多糖的生物活性功能、活血化瘀作用与免疫保健作用方面。研究者将EPS的多糖应用于生物医药工程至今，发现了诸如抗肿瘤作用、对免疫功能的影响、实验性微循环障碍的保护作用、抗血栓作用、抗内皮细胞损伤作用、抗凝血作用[38]、降血糖作用、抗衰老作用、抗辐射作用、抗病毒作用、预防和治疗肿瘤及艾滋病等生物活性[39]。

对于胞外多糖在生物医学方面的研究大都集中从细菌藻类中提取的，而微生物其他方面的研究似乎不多。EPS及其主要成分会在生物医药领域得到越来越广泛的应用。朱长亮等[32]认为主要将体现在以下几个方面：①用于绿色生物试剂的研制；②用于环保保健药品的生产；③用于对暂时不能有效治疗的顽疾的研究。

4.4 在食品加工方面 食品加工业中对EPS主要是利用其中的多糖类。胞外多糖可以用作食品添加剂、稳定剂、抗凝剂、保鲜剂、调味剂等，已经获得实际应用的有结冷胶、黄原胶[32]、海藻糖[40]等。黄原胶在啤酒中作泡沫稳定剂，在奶酪和冷冻食品中作冻融稳定剂，在肉制品加工中作保鲜剂，在果酱和糖浆等中作增稠剂等。结冷胶作为一种新的生物食品添加剂具有用量少、性能更加稳定、凝结度高、凝胶清亮和呈味性能优良等优点。海藻糖被用作可以应用到各种各样的食品和调味料等中，从而可以大大改善食品的质量并增加食品的花色品种，促进食品工业的进一步发展。

EPS及其主要成分会越来越多地在食品工业中被应用主要将体现在以下几个方面：①开发绿色环保的食品；②用于糖果、无油蛋糕、冰激凌等产品的生产；③作为优良的天然的食品调味剂，改善食品的口感，增加食品的风味；④用作绿色环保的保鲜剂、干燥剂、防腐剂。

4.5 在生态、修复方面 EPS的主要成分胞外多糖，它们对土壤的形成可能是很重要的，因为它们能保持土壤湿润，而且由于具有很好的黏性，可以将土壤颗粒聚积在一起，防止水和风的侵蚀[40]。Mazor等[41]研究表明，蓝藻胞外多糖在荒漠微生物结皮中起关键作用，一方面能在夏季7-8月保持土壤湿润，另一方面能保护结皮的微生物群落。这样EPS对沙漠治理方面能起到重要的作用。

在稻田中一些藻类能产生的大量胞外蛋白聚糖，可以形成黏质或胶质，在旱季时固定水分。以这种方式保持的土壤水分可以被水稻利用，这样在有些地区可以延长水稻的生长季节，使更多的植株成熟，从而提高产量。因此，在水稻田中EPS对于提高土壤的营养水分有很大的帮助[39]。

在其他类如化妆品工业（悬浮剂、乳化剂）、纺织（印染）工业（絮凝剂脱色）和石油工业（增强石油回收）等其他领域内也有广泛的应用。

5 前景与展望

今后随着生物科技的普及以及仪器设备的日益发展，人们对微生物EPS的研究、认识将会不断深入，应用领域将会更快地拓展。笔者认为微生物EPS以后的研究重点将集中在以下几个方面：①有目的筛选出高产EPS的微生物，寻找先进技术方法（如基因技术），优化培养条件，大批量提取目的EPS，能够在量和质上突破EPS现有的研究和使用水平。②对EPS现有的单一的物理、化学提取方法过程进行完善，能够开发整合出更多物理化学联合提取技术。研究出更多更新的物理、化学及物理化学联合技术，从生物技术方面寻找突破，能够开发出生物方法提取出EPS。③能够针对EPS建立一套标准规范的提取方法和评价方法，以便使不同研究者对不同EPS载体的研究能够建立在更加统一、有效、合理、有比较的平台上。④寻找并整合出针对不同微生物的EPS组成成分的分析方法，建立更有效的仪器分析方法，为描述EPS的主要成分和特性提供更多的理论依据。⑤研究利用EPS更多的潜在功能。现有的实际工程应用大都利用了EPS的主要成分——胞外多糖的成分特性，对于EPS的其他成分——蛋白质、核酸、糖醛酸等的利用却很少提及，因此，对其他成分的特性应用可以增加研究的力度。这样能够对EPS的所有成分更有效的应用，并可突破现有应用领域的范围，在新的领域中替代传统的产品。⑥消除EPS在实际应用过程中的消极作用，如进一步研究生物运行条件对活性污泥中EPS含量的影响，确定EPS含量对MBR性能影响最小的生物运行条件。

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X172

C

1000-2138（2012）03-0297-05

2011-12-08

国家自然科学基金资助项目（51108351）；国家自然科学基金资助项目（51108350）；国家自然科学基金资助项目（51078282）。

皋德祥（1987-），男，江苏盐城人，硕士生。

葛利云，副教授，Email：glymail@163.com。

吴健敏）

·高教研究·