惠东地区产ESBLs大肠埃希菌中TEM型β-内酰胺酶临床研究

周世娟 钟惠香 陈锦顺 吕福应 郭国才 黎敦镇

广东省惠东县中医院检验科，广东惠东 516300

流行病学研究表明，当今世界范围内，由质粒所介导的产超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum beta lactamases，ESBLs）是细菌耐药的主要机制之一[1-2]。产ESBLs阴性杆菌多见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等。近几十年来，随着广谱抗菌药物的广泛使用，产ESBLs的大肠埃希菌已成为目前院内感染最常见的耐药菌之一[3-4]。广泛耐药的大肠埃希菌给疾病治疗带来了严重的挑战，严重影响着医疗质量，同时还增加了患者的经济支出，因此，明确产ESBLs大肠埃希菌的耐药机制、研制新的治疗靶点以及减少细菌耐药率成为现阶段的研究热点之一[5]。本研究拟收集笔者所在医院产ESBLs大肠埃希菌，分析其主要耐药率和基因突变情况，并通过分子生物学方法明确基因碱基突变的主要类型，为今后进一步研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 产ESBLs大肠埃希菌标本的来源

标本收集时间为2012年1 ～ 5月，标本来源主要为惠东县中医院临床科室，包括：血、尿、痰、大便、穿刺液、分泌物、胆汁中分离的纯培养菌株。采用法国Biomerieux公司的API鉴定试剂条（API 20E）进行鉴定，并用产ESBLs表型确证实验筛选出产ESBLs大肠埃希菌86株：按CLSI文件M100-S20（2010年版）判断标准：头孢他啶和头孢噻肟中任何一种药物，加克拉维酸与相应不加克拉维酸后抑菌环直径相比，增大5 mm及以上时判断为ESBLs阳性。

1.2 抗菌药物的使用

本研究所采用的药物如下：头孢拉定（CRD，杭州赛诺菲万安特民生制药有限公司， H33022275）、氨苄西林（AMP，广州白云山制药股份有限公司，H20043038）、头孢呋辛（CXM，葛兰素史克公司，H20030365）、头孢他啶（CAZ，葛兰素史克公司，J20030063）、头孢哌酮/舒巴坦（SPR，辉瑞制药有限公司，H20020597）、氨曲南（ATM，中美上海施贵宝制药有限公司，H10970024）、亚胺培南/西司他丁（TN，默沙东制药有限公司，J20080046）、美罗培南[MP，住友制药（苏州）有限公司，J20100045]、左氧氟沙星[LFX，第一三共制药（北京）有限公司，H20000655]、阿米卡星（AMK，苏州一药有限公司，H20090327）。

1.3 荧光定量PCR反应

所有标本均送中山大学达安基因公司进行检测，采用荧光定量PCR法检测大肠埃希菌TEM型β-内酰胺酶基因，PCR试剂盒由中山大学达安基因公司提供。

Forward Primer（正向引物）：5’-GGCTGGTTAACGACGTTACGACT-3’，Reverse Primer（反向引物）： 5’-AAACGTTCAGGACGGGCTA-3’。肺炎克雷伯菌ATCC700603为阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照。

仪器：ABI 7500全自动荧光定量PCR仪，ABI 9700 PCR仪，ABI 3900台式高通量DNA合成仪，科大创新HC-3018R高速冷冻离心机。

1.4 药敏试验分析

本研究采用琼脂稀释法测定药物最低抑菌浓度（minimal inhibition concentration，MIC），方法和药敏判断标准按照CLSI文件M100-S20（2010年版）规定。β-内酰胺酶类抗菌药物测定采用MIC法；非β-内酰胺酶类抗菌药物则采用临界浓度法测定药物敏感性。培养基为Mueller-Hintom琼脂（OXOID，Basingstoke，UK）。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.5 DNA序列测定及分析

用ABI 377全自动测序仪对TEM酶全编码基因的PCR扩增产物分别进行序列分析，测序结果在PUBMED Genebank在线比较基因序列。

2 结果

2.1 产ESBLs大肠埃希菌基因型

本课题所收集并分离的86株产ESBLs大肠埃希菌，其中TEM基因型49株（57.0%），SHV基因型16株（18.6%），CTX-M基因型21株（24.4%）；TEM分型主要有TEM-1、TEM-2、TEM-105、TEM-116和TEM-128，其中TEM-1和TEM-2型例数最多，分别为19例和17例。

2.2 产ESBLs大肠埃希菌耐药性分析

由表1可见，医院产ESBLs大肠埃希菌TEM型耐药发生率较高；除亚胺培南/西司他丁和美罗培南敏感外，所有基因亚型细菌对β-内酰胺酶类和非β-内酰胺酶类抗菌药物均耐药。

2.3 产ESBLs大肠埃希菌TEM基因碱基突变类型

由表2可见，产ESBLs大肠埃希菌TEM基因碱基突变类型包括缺失、碱基置换、移码和插入，其中缺失发生率最高，其次为碱基置换，而移码突变和插入突变较少。

表1 产ESBLs大肠埃希菌TEM分型及耐药性

表2 产ESBLs大肠埃希菌TEM基因突变类型

3 讨论

本研究结果表明，目前惠东地区产ESBLs大肠埃希菌基因类型主要为TEM、SHV和CTX-M 三种类型，其中TEM基因型最常见，约占57.0%，而SHV和CTX-M基因型分别为18.6%和24.4%。TEM基因型中TEM-1和TEM-2所占例数最多，分别为18例和17例。基因分析结果表明，产ESBLs大肠埃希菌TEM基因突变类型主要为缺失和碱基置换。药敏实验结果提示，除亚胺培南/西司他丁和美罗培南敏感外，所有TEM基因亚型细菌对β-内酰胺酶类和非β-内酰胺酶类抗菌药物均耐药。

近年来，大量临床研究结果表明，产ESBLs大肠埃希菌耐药率呈逐年上升的趋势，且逐渐成为院内感染的头号致病菌[6]。不同基因亚型ESBLs对药物的敏感性和耐药率存在较大的差异，导致临床工作中时常出现同种细菌对同种抗菌药物表现出不同耐药性的现象[7]，严重影响着抗菌药物的选择，因此，探讨某一地区主要致病菌耐药发生率、抗菌药物敏感性、耐药基因类型以及主要碱基突变类型对指导抗菌药物的选择、改善医疗质量具有重要的临床价值和社会意义。

ESBLs主要包括TEM、SHV、CTX-M和OXA四种类型[7-8]。其中SHV和OXA为TEM的主要衍生物。既往研究报道TEM型ESBLs大肠埃希菌发病率逐渐增高，且各地区流行的基因亚型各不相同。近年来国内有关TEM 型ESBLs报道不断增多，TEM主要包括TEM-1型和TEM-2型，并发现了许多新的亚型，但目前尚未见惠东地区该酶的分子流行病学研究报道。TEM-1型ESBLs酶是革兰阴性菌最常见的β-内酰胺酶[9]。既往文献报道90%以上大肠埃希菌对氨苄西林耐药是由TEM-1 型ESBLs所介导[10]。TEM-1 型ESBLs能够水解青霉素以及头孢类抗菌药物，从而导致细菌的耐药。TEM-2型是由TEM-1型单个氨基酸的替换衍生而来。研究表明，不同的基因类型可导致同一种抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌的敏感性不同[11]。因此，积极寻找不同基因型ESBLs大肠埃希菌的生物学特点对于指导抗菌药物的选择及应用具有重要的临床意义。本研究结果在一定程度上反应惠东地区产ESBLs大肠埃希菌的流行病学情况，耐药基因主要类型和碱基突变位点，以及对抗菌药物的敏感性，从而在一定能够程度上弥补了本地区产ESBLs大肠埃希菌流行病学情况的空白，也在一定程度上为临床医师抗菌药物的选择提供理论。

综上所述，笔者认为，在今后研究中，可进一步增加样本收集量，从而使该项研究结果具有更好的代表性。

[1] 林红燕，叶晓光，魏衍超.产超广谱β-内酰胺酶菌耐药谱3年的变迁[J].中华医院感染学杂志，2003，13（9）：868-870.

[2] 姚正国， 范秋莲， 陈国强.产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科细菌医院感染与耐药表型分析[J].中华医院感染学杂志，2004，14（6）：684-685.

[3] 季淑娟，顾怡明，谭文涛.中国部分地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β内酰胺酶基因型研究[J].中华检验医学杂志，2004，27（9）：590-593.

[4] 王爱茶， 叶爱菊， 卢芝君.大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌诱导产ESBLs的危险因素和耐药分析[J].中国微生态学杂志，2008，20（2）：184-186.

[5] 赵杨， 张锐.院内产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌感染临床用药分析[J].吉林医学，2010，31（6）：786-787.

[6] 马越， 金少鸿.我国细菌耐药性检测研究的新特点[J].中华检验医学杂志，2005，28（4）：346-347.

[7] Jacoby GA. Epidemiology of extended spectrum β-lactamases[J].Clin Infect Dis，1998，27（1）：81-83.

[8] 彭少华， 李从荣， 施金玲.产超广谱β-内酰胺酶细菌测及耐药性观察[J].中华检验医学杂志， 2001， 24（6）： 350-352.

[9] 李家斌，李惠，李旭，等.合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株TEM型耐药基因分布[J].中华医院感染学杂志，2004，4（10）：1091-1093.

[10] Yagi T，Kurokawa H，Shibata N，et al.A preliminary survey of extended spectrum β-lactamases（ESBLs）in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan[J].FEMS Microbiol Lett，2000， 184：53-56.

[11] 王培兰，苏伟，刘又宁.β-内酰胺抗菌药物及其复合制剂对医院感染菌株体外抗菌活性研究[J].中华医院感染学杂志，2006，16（1）：9-11.