灵芝对肝癌干细胞糖代谢和标志物蛋白的影响

安玉会，王洁琼，徐 衍，崔海涛，马乾坤，李芳芳，何一昕

(郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室 河南郑州 450001)

1980年至2005年，全球癌症的年发病人数增加了1倍，从600万人上升到1 200万人［1］。据1999年的统计，肝癌的病死率在各种癌症中排第4位，在男性则为第3位，共有42.7万人死于肝癌［2］。肝癌在世界人口的标化死亡率为17.72/10万，在中国人口的标化死亡率为13.45/10万［3］。

尽管化疗药物可以快速缩小肿瘤的体积，但治疗后的复发仍高比率的出现于肿瘤病人中。其根本原因是这些化疗药物在根除癌干细胞方面是低效率的。新的研究发现，天然存在的营养性化合物为癌的化学预防提供了可能［4］，因为它们能直接或间接地影响癌干细胞的增殖途径［5］。对灵芝的抗癌作用研究表明，灵芝能抑制癌的侵润和转移，具有良好的肿瘤化学防治作用［6］，但抑制机理不明，是否是灵芝对癌干细胞发挥了作用，尚未见到相关报道。本文报告灵芝对人肝癌细胞中己糖激酶活性和肝癌干细胞中CD133蛋白的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞分组并进行药物处理 取对数生长期的肝癌SMMC7721细胞进行96孔铺板，每孔接种细胞104个。细胞贴壁后，分别用不同浓度(100、200、300、400、500 μg/ml)的灵芝L08处理24 h、48 h、72 h。其中每种药物每个浓度做3个平行实验，设置一个对照组和100、200、300、400、500 μg/ml的阳性对照组(环磷酰胺组)。

1.2 肿瘤细胞抑制率的测定 将加药处理24 h、48 h、72 h后的肝癌SMMC7721细胞培养液中加入MTT (5 mg/ml)，每孔20 μl，孵育4 h。终止孵育时，小心弃去孔内液体，每孔加入150 μl的DMSO，利用酶标仪在450 nm测定其OD值。抑制率(%)=(对照组OD值-加药处理组OD值)/对照组OD值×100%。

1.3 己糖激酶活性测定的测定 处理细胞后终止培养，破裂细胞。按照己糖激酶试剂盒操作流程进行加样，混匀，记录30 s时340 nm波长处的吸光度(A1值)，将比色皿中的反应液倒入预先编号的试管中，放入37℃水浴20 min，测定20 min30 s的吸光度(A2值)。HK活性(U/g protein)=(A2－A1)/毫摩尔消光系数×1/(反应时间×比色光径)×反应体系中样本稀释倍数×1 000。

1.4 CD133蛋白的测定方法 收集处理24 h后的细胞反复冻融并离心。收集上清液测定蛋白含量。取蛋白样品，加入等量的loading buffer。振荡混匀，煮沸5 min，离心后110 V电泳至胶下缘。取胶，转膜，室温封闭2 h。洗膜3次后加入一抗(1 μg/ml)。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(即二抗)，室温孵育1 h。洗膜并用辣根过氧化酶-DAB法染色。出现明显的棕色蛋白条带停止染色。用灰度仪扫描棕色蛋白条带。

1.5 统计学分析 MTT和己糖激酶活性测定所得的数据利用SPSS 17.0进行数据分析，各组分别同阴性对照组、阳性对照组进行t检验分析。不同药物浓度的组内进行F检验分析，数据用±s表示。组间数据比较用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 灵芝L08对细胞增殖的抑制 灵芝L08对人肝癌SMMC7721细胞的增殖具有明显的抑制作用。与化疗药物环磷酰胺比，200 μg/ml以下浓度的灵芝L08作用人肝癌SMMC7721细胞24 h，其抑制率低于环磷酰胺。但作用时间超过48 h以上，200 μg/ml的灵芝L08均比同样浓度的环磷酰胺对人肝癌SMMC7721细胞的增殖具有更强的抑制作用。并且，随着灵芝L08浓度和作用时间的增加，其抑制率更高。不同浓度的灵芝L08和环磷酰胺对细胞增殖作用的抑制率，见表1～3。

表1 灵芝L08和环磷酰胺对肝癌SMMC7721细胞处理24 h增殖的影响(±s)

表1 灵芝L08和环磷酰胺对肝癌SMMC7721细胞处理24 h增殖的影响(±s)

灵芝L08组总F=25.41，P＜0.05;环磷酰胺组总F=22.45，P＜0.05。

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表2 灵芝L08和环磷酰胺对肝癌SMMC7721细胞处理48 h增殖的影响(±s)

表2 灵芝L08和环磷酰胺对肝癌SMMC7721细胞处理48 h增殖的影响(±s)

灵芝L08组总F=53.37，P＜0.05;环磷酰胺组总F=32.11，P＜0.05。

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表3 灵芝L08和环磷酰胺对肝癌SMMC7721细胞处理72 h增殖的影响(±s)

表3 灵芝L08和环磷酰胺对肝癌SMMC7721细胞处理72 h增殖的影响(±s)

灵芝L08组总F=24.28，P＜0.05;环磷酰胺组总F=57.16，P＜0.05。

抑制率(%)组别 n OD值0.58±0.024 0.54±0.021 0±0.025 0±0.020 100 μg/ml 6 0.50±0.032 0.48±0.016 17.27±0.027 14.01±0.017 200 μg/ml 6 0.45±0.018 0.44±0.012 25.21±0.020 20.83±0.020 300 μg/ml 6 0.39±0.062 0.35±0.025 37.53±0.045 41.31±0.023 400 μg/ml 6 0.22±0.039 0.26±0.017 71.64±0.037 60.72±0.018 500 μg/ml 6 0.12±0.006 0.14±0.025 92.20±0.010 86.环磷酰胺正常对照灵芝L08环磷酰胺 灵芝L08 6 63±0.022

2.2 灵芝L08对己糖激酶活性的抑制 灵芝L08和环磷酰胺均能降低人肝癌SMMC7721细胞己糖激酶的活性。随着灵芝L08和环磷酰胺浓度的增加，它们对己糖激酶的抑制率也逐步增加。但随着它们对细胞作用时间的增加，各浓度对应组的抑制作用则逐步降低。不同浓度的灵芝L08和环磷酰胺对细胞中己糖激酶的抑制率，见表4～6。

表4 灵芝L08和环磷酰胺处理肝癌SMMC7721细胞24 h对己糖激酶活性的影响(±s)

表4 灵芝L08和环磷酰胺处理肝癌SMMC7721细胞24 h对己糖激酶活性的影响(±s)

抑制率(%)组别 n OD值0.277±0.011 0.689±0.031 0±0.016 0±0.027 100 μg/ml 6 0.232±0.026 0.573±0.023 16.3±0.023 16.9±0.021 200 μg/ml 6 0.227±0.025 0.567±0.026 18.1±0.021 17.8±0.023 300 μg/ml 6 0.221±0.016 0.548±0.018 20.3±0.020 20.5±0.020 400 μg/ml 6 0.209±0.019 0.536±0.030 24.6±0.017 22.3±0.025 500 μg/ml 6 0.196±0.023 0.531±0.016 29.3±0.024 23环磷酰胺正常对照灵芝L08环磷酰胺 灵芝L08 6.0±0.017

灵芝L08组总F=27.89，P＜0.05;环磷酰胺组总F=45.31，P＜0.05。

表5 灵芝L08和环磷酰胺处理肝癌SMMC7721细胞48 h对己糖激酶活性的影响(±s)

表5 灵芝L08和环磷酰胺处理肝癌SMMC7721细胞48 h对己糖激酶活性的影响(±s)

灵芝L08组总F=32.36，P＜0.05;环磷酰胺组总F=27.03，P＜0.05。

抑制率(%)组别 n OD值0.265±0.019 0.667±0.018 0±0.020 0±0.019 100 μg/ml 6 0.230±0.016 0.562±0.026 13.3±0.017 15.8±0.023 200 μg/ml 6 0.222±0.014 0.558±0.017 16.3±0.018 16.4±0.018 300 μg/ml 6 0.216±0.024 0.550±0.024 18.5±0.022 17.6±0.022 400 μg/ml 6 0.204±0.013 0.533±0.019 23.1±0.016 20.1±0.020 500 μg/ml 6 0.194±0.027 0.530±0.036 26.8±0.024 20环磷酰胺正常对照灵芝L08环磷酰胺 灵芝L08 6.6±0.027

表6 灵芝L08和环磷酰胺处理肝癌SMMC7721细胞48 h对己糖激酶活性的影响(±s)

表6 灵芝L08和环磷酰胺处理肝癌SMMC7721细胞48 h对己糖激酶活性的影响(±s)

灵芝L08组总F=25.75，P＜0.05;环磷酰胺组总F=35.38，P＜0.05。

抑制率(%)组别 n OD值0.263±0.016 0.660±0.034 0±0.017 0±0.027 100 μg/ml 6 0.227±0.013 0.559±0.033 13.7±0.016 15.4±0.025 200 μg/ml 6 0.219±0.019 0.556±0.028 16.8±0.020 15.8±0.023 300 μg/ml 6 0.214±0.013 0.548±0.023 18.7±0.023 17.0±0.022 400 μg/ml 6 0.201±0.014 0.534±0.030 23.6±0.020 19.1±0.024 500 μg/ml 6 0.194±0.023 0.531±0.036 26.3±0.024 19环磷酰胺正常对照灵芝L08环磷酰胺 灵芝L08 6.6±0.025

2.3 灵芝L08对SMMC772细胞CD133蛋白水平的影响 灵芝L08能降低癌干细胞的标志物蛋白CD133的水平，并且随着灵芝浓度的增加，CD133蛋白的水平显著降低。环磷酰胺也能少量降低CD133蛋白的水平，但随着环磷酰胺浓度的增加，CD133蛋白的水平并没有明显的改变。不同浓度的灵芝L08和环磷酰胺对肝癌干细胞中CD133蛋白水平的影响见图1、图2和表7。

表7 灵芝L08和环磷酰胺处理SMMC772细胞后CD133蛋白条带的灰度值(±s)

表7 灵芝L08和环磷酰胺处理SMMC772细胞后CD133蛋白条带的灰度值(±s)

灵芝L08组总F=215.88，P＜0.05;环磷酰胺组总F=82.21，P＜0.05。

P组别 n 环磷酰胺空白对照组灰度值灵芝L08环磷酰胺 灵芝L08 3 348.25±7.993 354.75±9.205 100 μg/ml 3 257.50±8.510 249.00±5.401 0.000 0.000 200 μg/ml 3 202.25±6.156 234.75±5.360 0.000 0.000 400 μg/ml 3 101.00±4.916 246.25±3.198 0.000 0.000

3 讨论

实验结果显示，灵芝 L08能抑制人肝癌SMMC7721细胞的增殖。随着浓度和时间的增加，灵芝L08比同样浓度的环磷酰胺对细胞的抑制率更高。肿瘤组织即使在氧供应充分的条件下也主要以无氧糖酵解获取能量［7］，而己糖激酶是催化无氧糖酵解第一步反应的关键酶［8］。灵芝L08能抑制人肝癌细胞己糖激酶的活性，从而可抑制癌细胞通过无氧糖酵解获取增殖的能量，阻止人肝癌细胞的增殖。

Suetsugu等［9］证实，CD133蛋白阳性的肝癌细胞具有癌干细胞样的性质。Lingala等［10］证明在肝细胞癌表面存在着CD133蛋白。在先前的研究中，作者也证实人肝癌SMMC7721细胞系中存在着CD133阳性的癌干细胞［11］。灵芝 L08降低人肝癌干细胞的CD133蛋白的水平，一方面表明灵芝L08抑制了人肝癌干细胞的CD133基因的表达，因此降低了CD133蛋白水平。可能灵芝L08抑制了人肝癌干细胞的增殖，减少了人肝癌干细胞数，因此CD133蛋白水平有了明显降低。但是，灵芝是因为抑制了CD133基因的表达才阻止了肝癌干细胞的增殖，还是抑制了肝癌干细胞增殖才降低了CD133蛋白的水平，须要进一步研究。但可以肯定肝癌干细胞增殖的抑制和减少，阻止了癌细胞的增殖、浸润、转移和复发可能。

在中国、日本、朝鲜和亚洲许多国家，灵芝曾被用作传统药物治疗多种疾病［12］。对灵芝的抗癌作用研究表明，灵芝能抑制癌细胞的侵润和转移，具有良好的肿瘤化学预防作用［6］。本研究的结果表明，灵芝可抑制肝癌细胞己糖激酶的活性，因而也就抑制了肝癌细胞和癌干细胞增殖的能量来源。同时，灵芝也降低了CD133蛋白的水平，抑制了癌干细胞的增殖。灵芝作为公认的传统草药在癌的预防和治疗中必将发挥更大的作用。

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