一株生物表面活性剂产生菌的优选及其产物性质研究

2012-03-14黄翔峰陆丽君彭开铭詹鹏举

井冈山大学学报(自然科学版) 2012年3期

黄翔峰，朱菡，陆丽君，彭开铭，詹鹏举，刘佳

黄翔峰，朱菡，*陆丽君，彭开铭，詹鹏举，刘佳

（同济大学环境科学与工程学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室，上海，200092）

从实验室保藏的22株生物表面活性剂产生菌中优选出一株具有显著表面活性的枯草芽孢杆菌CICC 23659，研究4种培养基对该菌株产生的生物表面活性剂产量及性质的影响，结果发现MMSM培养基培养得到的产物表面活性最高。2 g/L的粗产物具有显著的排油活性，对中长链烷烃和苯环类疏水性物质具有较好的乳化效果，且能形成稳定的乳状液。纯化产物的CMC为31.5 mg/L，最低表面张力为27.8 mN/m。产物经TLC、红外光谱及高效液相色谱鉴定为surfactin。

枯草芽孢杆菌；生物表面活性剂；乳化能力；表面活性；鉴定

微生物在一定条件下培养时，其代谢过程会分泌一些具有表界面活性，集亲水基和疏水基结构于一分子的两亲化合物，即生物表面活性剂。据报道，生物表面活性剂主要有糖脂、脂肽和脂蛋白、脂肪酸和磷脂、聚合物和全胞表面本身等五大类[1]。其中脂肽类表面活性剂具有独特的结构和生理功能，能促进细菌聚集、促进疏水性物质的溶解，以提高细胞的同化作用等[2]，并对温度、酸碱、盐离子等化学物质具有稳定性。因其无毒、高效、易降解的优点，目前已逐渐应用于石油回收、溢油控制、土壤修复[3]、农作物病害防治[4]等领域，引起研究者的广泛重视。

本研究从多株生物表面活性剂产生菌中优选出一株枯草芽孢杆菌，并确定合适的培养基发酵产生物表面活性剂，考察该产物对各类疏水性物质的乳化能力，并采用TLC、红外光谱、高效液相色谱技术鉴定该生物表面活性剂类型。

1 材料与方法

1.1 菌株及培养基

CICC 23659、CICC 10275、CICC 23642购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，AB 93108、AB 92006由湖南大学惠赠，其它菌株为本实验室自行从污水厂剩余污泥、油田土壤中分离。

本研究中用到的培养基参见文献[5]-文献[10]，具体配方如下：

肉汤培养基[5]：牛肉浸膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 mL，pH = 7.0。

蔗糖培养基[5]：蔗糖20 g，NH4NO34.0 g，KH2PO46 g，K2HPO4·3H2O 5.24 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 1.0 mg，FeSO4·7H2O 1.0 mg，EDTA二钠1.4 mg，蒸馏水1000 mL，pH = 7.0。

植物油培养基[5]：葵花籽油4 %，NH4NO34.0 g，KH2PO46 g，K2HPO4·3H2O 5.24 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 1.0 mg，FeSO4·7H2O 1.0 mg，EDTA二钠1.4 mg，蒸馏水1000 mL，pH = 7.0。

种子培养基[6]（BPY培养基）：牛肉浸膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸馏水1000 mL，pH = 7.0。

Landy培养基[7]：葡萄糖20.0 g，L-谷氨酸钠 5.0 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，FeSO40.15 mg， MnSO45.0 mg，CuSO40.16 mg，蒸馏水1000 mL，pH = 7.0。

MMSM培养基[8]：葡萄糖40.0 g，NH4NO34.0 g，KH2PO44.1 g，Na2HPO4·12H2O 14.33 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.8 mg，FeSO4·7H2O 1.1 mg，EDTA二钠1.3 mg，蒸馏水1000 mL，pH = 7.0。

MSM培养基[9]：葡萄糖4.0 g，(NH4)2SO41.0 g，K2HPO4·3H2O 4.8 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，酵母粉0.1 g，Na3C6H5O7·2H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.2 mg，FeSO4·7H2O 0.2 mg，蒸馏水1000 mL，pH = 7.0。

基础培养基[10]：可溶性淀粉20.0 g，NH4NO36.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.08 g，酵母粉 0.6 g，KH2PO42.0 g，Na2HPO4·12H2O 8.0 g，蒸馏水1000 mL ，pH = 7.0。

1.2 主要试剂

乙腈、甲醇、三氟乙酸均为色谱级，其他实验用试剂为分析纯，均为国药集团化学试剂产品。Surfactin标样购自美国sigma公司。

1.3 生物表面活性剂粗品的分离提取

接种一环菌体于100 mL种子培养基中，于28 ℃、130 rpm下培养12 h，再以5 %的接种量接种于100 mL发酵培养基中，于28 ℃、130 rpm摇床培养24 h。在4 ℃、12000 rpm下将发酵液离心10 min，去除菌体，上清液用6 mol/L HCl调节至pH = 2.0，在4 ℃冰箱中放置过夜。离心收集褐色沉淀，并用pH = 2的稀盐酸洗涤两遍。用NaOH 溶液将沉淀物的pH 值调至7.0，冷冻干燥后待用。

1.4 生物表面活性剂粗品的纯化

将冷冻干燥所得粗产物用CHCl3/CH3OH(体积比3:1)抽提24 h，合并萃取相，减压蒸发去除有机相。加入正己烷洗涤3次除去脂肪酸等，离心收集沉淀物并干燥，最后用 CH2Cl2于50 ℃抽提10 h，减压蒸发去除CH2Cl2，即得纯化的生物表面活性剂，纯化样品为黄绿色晶状物。

1.5 TLC分析

生物表面活性剂样品溶于CH2Cl2中，点样于两块硅胶板上，分别以CHCl3/CH3COOH（体积比8:2）为展开剂，薄板层析展开，吹干；其中一块硅胶板喷洒蒸馏水显色，另一块喷洒茚三酮显色剂加热显色。把喷洒茚三酮硅胶板放入密封容器内，在110 ℃加热1 h，用浓盐酸原位水解[11]，再喷洒茚三酮显色剂加热显色。

1.6 红外光谱分析

将KBr充分研磨至颗粒直径达到2 μm以下，再按照样品:KBr = 1:100的比例，将纯化后的生物表面活性剂与KBr混合研磨均匀，放入磨具内压成透明的薄片。用镊子将薄片装入磁性样品架上，放入Nicolet 5700智能傅立叶红外光谱仪的样品室中，先测空白背景，再将样品置于光路中，测量样品红外光谱图。

1.7 高效液相色谱分析

HPLC系统为Waters e2695型仪器，配Water 2489紫外/可见光检测器；色谱柱为Kromasil公司的KromasilC18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流速，0.84 mL/min；柱温，30 ℃；检测波长，214 nm；流动相A为水（含0.1 %TFA），流动相B为乙腈。洗脱程序：0 min，40 %A；9~30 min，7 %A。

1.8 产物CMC及上清液CMD的测定[12]

临界胶束浓度(CMC)是指形成一定形状的胶团所需表面活性物质的最低浓度，是表面活性剂的一个重要特征。将产物配成2 g/L的溶液，经蒸馏水逐级稀释并测定其表面张力，直至表面张力近于水的表面张力(72.0 mN/m)，记录数据并绘制成曲线，表面张力急剧上升时的产物浓度即为CMC。而CMD是指将含表面活性剂的溶液不断稀释，表面张力突然上升时的稀释倍数。对于某些种类和浓度尚不十分明确的生物表面活性剂，可以采用CMD来表示其活性。用DT-102型全自动张力仪于25 ℃下测定发酵液及产物溶液的表面张力。

1.9 乳化能力

将5 mL发酵液或产物溶液与5 ml煤油混合，于2500 rpm下震荡2 min，静置0.5、24、48 h后分别读取乳化层高度。

2 结果与讨论

2.1 生物表面活性剂产生菌的优选

实验室保藏菌株经肉汤培养基活化后，分别用蔗糖和葵花籽油作为碳源发酵培养，3种培养基全培养液的表面张力见表1。从表面张力来看，菌株CICC 23659和菌株CICC 10275的蔗糖发酵培养基和植物油培养基全培养液明显低于其他菌株。其中菌株CICC 23659能将蔗糖培养基的表面张力从61.3 mN/m降低至24.7 mN/m，将植物油培养基的表面张力从67.9 mN/m降低至25.5 mN/m。由此看来，菌株CICC 23659在发酵培养的过程中产生了生物表面活性剂，使得发酵液具有显著的表面活性，后续研究选择表面活性最高的CICC 23659作为主要对象。

表1 生物表面活性剂产生菌的筛选结果

注：“/”表示该菌株尚未鉴定。

2.2 培养基的优选

表2列出了菌株CICC 23659在4种不同培养基培养时产量及其性质的差异。由表2可知，在相同发酵条件下，Landy培养基得到的生物表面活性剂粗产物产量最高，达到0.24 g/L，其次为MMSM培养基。但从粗产物的性质来看，MMSM培养基得到的生物表面活性剂粗产物的CMC最低，为125 mg/L，因此该培养基上清液的CMD值最高，达到16，即上清液稀释16倍时，表面张力仍能维持在30 mN/m左右。造成以上结果的原因可能是等电点为pH = 2左右的物质都可能被酸析沉淀，因此酸析沉淀法得到的粗产物除了生物表面活性剂之外，还可能含有其它不具有表面活性的物质，如氨基酸、蛋白质等。尽管Landy培养基得到的粗产物质量最大，但从CMC和CMD值来看，Landy培养基上清液中的表面活性物质含量仅为MMSM培养基的一半。从四种培养基培养得到的粗产物的排油圈直径中，也可得到相同的结论。MMSM培养基所得粗产物的排油活性最大，排油圈直径可达14 cm。而Landy培养基和MSM培养基得到的产物排油圈仅为MMSM培养基产物的一半，基础培养基得到的产物几乎无排油活性。

表2 不同培养基对表面活性剂粗产物产量及性质的影响

由以上这些性质可知，Landy培养基得到的粗产物量最大，但是由于粗产物中含有大量杂质，导致CMC值很大。MMSM培养基得到的粗产物产量虽不是最大，但粗产物CMC值最小，排油活性最大。因此，MMSM培养基是最适合生物表面活性剂产生菌发酵产表面活性物质的培养基。

2.3 生物表面活性剂的性质

2.3.1 生物表面活性剂的排油活性

将MMSM培养基得到的粗产物配成不同浓度，考察其排油活性。结果表明，粗产物的活性与浓度之间成正相关，粗产物浓度越高排油活性越显著（图1）。

图1 酸析粗产物的排油活性

图2 酸析粗产物对各疏水性物质的乳化作用

2.3.2 生物表面活性剂的乳化能力

将粗产物配成2 g/L的浓度，对不同油类进行乳化实验，由下图可知，此表面活性物质具有良好的乳化性能。除机油外，粗产物对各油类乳化能力均高于55 %，且静置48 h后仍能乳化层高度基本不变（图2）。因此粗产物对苯环类物质以及中长链烷烃均具有很好的乳化能力并形成稳定的乳状液。

粗产物纯化后得到晶体状的生物表面活性剂纯化样品，考察其不同浓度对煤油的乳化能力。结果表明，纯化得到的生物表面活性剂浓度为0.25 g/L时，对煤油的乳化能力为48 %，且48 h后乳化能力仍能维持在45 %，纯化样品具有较高的乳化能力和稳定性。当纯化样品浓度为0.5 g/L时，对煤油的乳化能力为60 %，且48 h后仍维持在58 %。当纯化样品浓度低于CMC（31 mg/L）时，基本无乳化能力（图3）。

图3 纯化产物对煤油的乳化作用

2.4 纯化产物的表面张力

蒸馏水的表面张力为71.0 mN/m，粗产物纯化后得到的样品在蒸馏水中的CMC为31.2 mg/L，最低表面张力值为27.8 mN/m。文献报道的最多的是枯草芽孢杆菌产生的脂肽类表面活性素surfactin，它能显著的降低水的表面张力，使其从70 mN/m下降至27 mN/m，CMC为25 mg/L，是已报道的表面活性最强的生物表面活性剂[13]。另外，地衣芽孢杆菌产生的地衣素[14]能将水的表面张力从71.8 mN/m降至35.5 mN/m，临界胶束浓度（CMC）为30.0 mg/L。假单胞菌XD-1[15]发酵产生的生物表面活性剂经鉴定为脂肽和糖脂的混合物，可将培养液的表面张力从70.0 mN/m降至30.2 mN/m，CMC值为50 mg/L。从最低表面张力值和CMC值来看，纯化产物与surfactin性质相似，还需采用其它手段验证。

2.5 生物表面活性剂的鉴定

2.5.1 TLC鉴定

氨基酸及含有游离氨基的肽或蛋白质能与茚三酮发生显色反应，是定性鉴定氨基酸和蛋白质的重要反应，除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮显黄色外，其他α-氨基酸与茚三酮随浓度的增大显红色到蓝紫色。

纯化后样品的TLC分析结果表明，直接喷洒蒸馏水，样品显白色疏水斑点，说明生物表面活性剂有疏水性成分。直接喷洒茚三酮显色剂加热，样品不显色，说明样品中不含游离氨基。采用浓盐酸原位酸解后，再喷洒茚三酮显色剂加热，样品显色（图4），说明样品经水解后含有游离氨基。样品显色表明样品为脂肽，且可能是氨基闭封的环脂肽。样品的比移值为0.63，surfactin标样的比移值为0.64，可认为样品比移值与surfactin相同。

左图用水显色，右图用茚三酮显色；a、a’为纯化样品，b、b’为surfactin

2.5.2 红外光谱鉴定

从生物表面活性剂的红外光谱图上发现脂肪链1382，1461 cm-1，酰胺键（肽键）1648，1540 cm-1，及内酯键1739 cm-1的特征吸收峰，N—H 3320 cm-1，饱和C—H 2927，2856 cm-1吸收峰（图5上）。检索显示，该样品的红外光谱与surfactin的红外光谱（图5下）有很好的相似性。TLC与红外光谱数据显示，该表面活性剂为脂肽，且无游离氨基，结合有内酯键及原位水解后对茚三酮显色的特性，肽部分应该为环状。

图5 样品（上）及surfactin（下）的红外光谱图

2.5.3 高效液相色谱鉴定

surfactin标准样品在高效液相色谱图上显示出5个主峰（图6），出峰时间分别为14.111 min、16.403 min、20.639 min、22.059 min和26.080 min。脂肽纯化样品经过HPLC分离得5个主峰，出峰时间为14.684 min、16.385 min、20.683 min、22.090 min和26.006 min，分别对应surfactin标准样品的5个主峰。因此，从纯化样品与surfactin的高效液相色谱图比对可知，菌株CICC 23659发酵产生的生物表面活性剂为surfactin。

3 结论

本试验从22株生物表面活性剂产生菌中优选出一株枯草芽孢杆菌CICC 23659，该菌株以MMSM培养基中得到的产物产量较高，且CMC值最小，该粗产物经纯化后CMC可达到31.2 mg/L，最低表面张力为27.8 mN/m。该生物表面活性剂对苯环类、中长链烷烃类油脂具有显著且稳定的乳化能力，且具有良好的排油活性，可推广应用于石油工业和环境工程领域。经TLC、红外光谱和高效液相鉴定，该生物表面活性剂为surfactin。

图6 样品（上）及surfactin（下）标准样品的高效液相色谱图

[1] Banat I M. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: A review[J]. Bioresource Technology, 1995, 51 (1):1-12.

[2] Bordoloi N K, Konwar B K. Bacterial biosurfactant in enhancing solubility and metabolism of petroleum hydrocarbons[J]. Journal of Hazardous Materials, 2009, 170 (1):495-505.

[3] Urum K, Pekdemir T. Evaluation of biosurfactants for crude oil contaminated soil washing[J]. Chemosphere, 2004, 57, (9):1139-1150.

[4] Mannanov R N, Sattarova R K. Antibiotics produced by bacillus bacteria[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2001, 37 (2):117-123.

[5] Huang X F, Liu J, Lu L J, et al. Evaluation of screening methods for demulsifying bacteria and characterization of lipopeptide bio-demulsifier produced by Alcaligenes sp[J]. Bioresource Technology, 2009, 100 (3):1358-1365.

[6] 方传记, 陆兆新, 孙力军,等.淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的优化[J]. 中国农业科学, 2008, 41 (2):533-539.

[7] Fickers P, Leclère V, Guez J S, et al. Temperature dependence of mycosubtilin homologue production in Bacillus subtilis ATCC6633[J]. Research in Microbiology, 159 (6):449-457.

[8] Wei Y H, Chu I M. Mn2+improves surfactin production by Bacillus subtilis[J]. Biotechnology Letters, 2002, 24 (6):479-482.

[9] 吕应年, 杨世忠, 牟伯中. 一种脂肽类生物表面活性剂产生菌的筛选[J]. 微生物学杂志, 2005, 25 (2):4-8.

[10] 丁立孝. 脂肽生物表面活性剂的发酵生产及其结构、性质研究[D]. 上海:同济大学,2004.

[11] 周俊, 谭宁华. 植物环肽的薄层化学识别新方法及其在植物化学研究中的应用[J]. 科学通报, 2000, 45 (10):1047-1051.

[12] Carrillo P G, Mardaraz C, Pitta-Alvarez S I, et al.Isolation and selection of biosurfactant-producing bacteria[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1996, 12 (1):82-84.

[13] Arima K, Kakinuma A, Tamura G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: Isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1968, 31 (3):488-494.

[14] 张翠竹,张心平, 梁凤来. 一株地衣芽孢杆菌产生的生物表面活性剂[J]. 南开大学学报:自然科学版, 2000, 33 (4):41-52.

[15] 尹华, 谢丹平, 彭辉,等. 假单胞菌XD-1(Pseuomonas XD-1)的产表面活性剂性能研究[J]. 环境科学学报, 2005, 25 (2):220-225.

SELECTION OF BIOSURFACTANT PRODUCING BACTERIUM AND STUDIES ON ITS PROPERTIES

HUANG Xiang-feng, ZHU Han,*LU Li-jun, PENG Kai-ming, ZHAN Peng-ju, LIU Jia

(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai, 200092,China)

CICC 23659 was optimized from 22 strains of biosurfactant-producing bacteria due to its significant surface activity. The medium screening experiment indicated that CICC 23659 could obtain high yield of biosurfactant with stable emulsifying ability and oil discharge activity in MMSM. 2 g/L crude product has significant oil discharge activity, displays remarkable emulsifying ability on hydrophobic substrate such as long chain alkane or benzodiazepines and can form stable emulsion.The CMC of purified product is 31.5 mg/L, and the lowest surface tention is 27.8 mN/m. The product was identified as surfactin by TLC, IR and HPLC analysis.

; biosurfactant; emulsifying ability; surface activity; identification

1674-8085(2012)03-0052-06

Q939.124

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.03.011

2011-12-24；

2012-02-27

国家自然科学基金项目(51108333;50908166);中国博士后特别资助基金项目(201104284;20100480621);上海市博士后基金项目(11R21416600);教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-10-0629）

黄翔峰(1974-)，男，福建古田人，教授，博士，主要从事水体污染控制与环境微生物研究(Email:hxf@tongji.edu.cn);

朱菡(1987-)，女，江苏无锡人，硕士生，主要从事水体污染控制与环境微生物研究(Email: zhuhanxt@hotmail.com);

*陆丽君(1982-)，女，上海松江人，讲师，硕士，主要从事水体污染控制与环境微生物研究(Email:lulijun@tongji.edu.cn);

彭开铭(1987-)，男，安徽临泉人，博士生，主要从事水体污染控制与环境微生物研究(Email:kai878@sina.com);

詹鹏举(1989-)，男，新疆呼图壁人，硕士生，主要从事水体污染控制与环境微生物研究(Email:zhanpengju@yahoo.com.cn);