雨生红球藻铁型超氧化物酶基因的克隆与序列分析

樊寅卯,张 蕾,秦 松严小军

(1.宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室,浙江 宁波 315211;2.中国科学院 烟台海岸带可持续发展研究所,山东 烟台 264003;3.中国科学院 研究生院,北京 100049)

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是体内清除氧自由基反应的第一大酶类,可以催化O-2发生歧化反应生成O2和H2O2,从而清除体内的O-2。植物体中主要含有3种SOD：MnSOD,Cu/ZnSOD和FeSOD。Cu/ZnSOD主要存在于细胞浆内;MnSOD主要存在于细胞浆和线粒体内;FeSOD存在于过氧化物酶体和叶绿体中。高等植物的FeSOD和MnSOD的序列和结构上具有较高的同源性,Cu/ZnSOD与MnSOD或FeSOD之间不存在同源性[1]。FeSOD在进化中属于一类古老的 SOD,因为厌氧古细菌中只存在这一种 SOD酶,在动物,真核生物和真菌中一般不含FeSOD。

FeSOD是抗氧化代谢途径中关键酶之一。FeSOD为环境诱导表达型,表达量高低受到温度、光、激素等环境因子的影响。各种化学物质和逆境胁迫因子都能引起FeSOD的高表达,从而减少氧胁迫对机体的伤害[2]。研究表明,FeSOD与植物的抗病性、抗盐性、耐脱水力、抗热性、耐寒性及抗除草剂的能力密切相关[3]。另外,微藻对低温及亚硫酸盐的抗性也与FeSOD的活性相关。

在自然界中,雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)主要分布在浅水地带或海边的岩石旁。所以雨生红球藻在整个生长的过程中不可避免的要遇到不良的生存环境,例如：营养缺乏、高温、干旱、紫外线伤害、高光强和冷(冻)害等。雨生红球藻能够适应不良的生存环境,一方面是雨生红球藻可以通过不同细胞形态之间的转变,即在适宜的环境中,它以绿色游动细胞的形式出现,一旦环境不适宜,其细胞壁加厚形成孢子囊[4]。另一方面是通过抗氧化系统,在雨生红球藻不同类型的细胞中,抗氧化机制有很大的差异,雨生红球藻细胞内存在两种抗氧化机制,一是绿色细胞中的抗氧化酶体系,二是红色细胞中的抗氧化物质虾青素,这两种抗氧化机制同时存在,共同作用[5]。对雨生红球藻FeSOD的克隆和表达分析有助于揭示雨生红球藻对环境的适应机理,以及抗氧化抗逆性的生理机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藻种和培养方法

雨生红球藻为中科院烟台海岸带所生物资源实验室所培养,在温度为 25℃,3000 lx的光照强度,12h/12h的光暗周期,与 MCM[6]培养基条件下静置培养,每天摇动一次。

1.1.2 试剂与仪器设备

试剂：Taq DNA聚合酶(Takara)、pMD-18T (Takara)、The SMART™ RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)、RNAprep pure Plant Kit(Tiangen)、反转录试剂盒(Takara)、氨苄青霉素钠(Sangon)、Marker(Takara)、胶回收试剂盒(Takara)、引物合成和测序送上海生工生物技术有限公司完成、大肠杆菌菌种top10(Escherichia colitop10)由本实验室保存。

主要仪器设备：主要使用仪器：光照培养箱(江南仪器厂)、PCR仪(Bio-Rad)、凝胶成像系统(Bio-Rad),低温台式离心机(ABI)、高压灭菌锅(上海精宏)、恒温水浴锅(上海精宏)。

1.2 方法

1.2.1 雨生红球藻总RNA的提取

采用RNA提取试剂盒(RNAprep pure Plant Kit)提取雨生红球藻的总RNA,具体操作参考RNAprep pure Plant Kit试剂盒的说明书。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。

1.2.2 cDNA第一链的合成

反转录反应体系(20 μL)如下：RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL;MMLV RT Buffer(5×)4 μL;MMLV RNaseH-(200 U/μL)0.5 μL;dNTP(10 mmol/L)2μL;Oligo dT15(0.2 mmol/L)2 μL;H2O(RNase-Free)5.5 μL;总 RNA(0.5 μg)5 μL。42℃温育 2 h,95℃变性 2 min,－20℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR法克隆HpFeSOD cDNA片段

根据GenBank中已注册的FeSOD氨基酸序列,用 codehop[7]设计雨生红球藻FeSOD的简并引物。codehop设计的简并引物 HpFeSODF1(5′-CCCAGATCTGGAACCACACCy-tntaytggva-3′)和 HpFeSODR1(5′-CGGTAGTCGATGTAGTAGGCGtgytcccanac-3′)。所有引物均由上海生物工程公司合成,见表1。

取第一链反应产物 1 μL,按下列反应体系(25 μL)PCR 扩增：10xPCR Buffer 2.5 μL;dNTP 2 μL;上下游简并PCR引物(10 mmol/L)1 μL;Taq DNA聚合酶(50 μ/L)0.25 μL;第一链反应的产物 1 μL;H2O 17.3 μL。

PCR扩增的程序是：94℃4 min,1个循环;94℃30 s,55℃30 s,72℃3 min,35 个循环;72℃10 min,1个循环;4℃保存。

取20 μL PCR反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行分析和回收;目的 DNA片段的胶回收参阅TAKARA公司的小量胶回收试剂盒说明书,凝胶的制备和操作参考分子克隆实验指南(第3版)[8]。

1.2.4 目的DNA片段的连接及转化

按照TaKaRa公司的T-A克隆载体连接试剂盒的说明书,将目的 DNA片段与 pMD18-T质粒载体16℃过夜连接;连接后转化已制备好的大肠杆菌感受态细胞,37℃培养箱中过夜培养。大肠杆菌感受态细胞的制备和连接转化等操作参考分子克隆实验指南(第3 版)[8]。

表1 实验中用到的引物及序列Tab.1 Primers used in the experiments

1.2.5 阳性克隆的筛选与检测

挑取能在含有Amp的LB培养基平板上生长的单菌落,进行PCR检测。

1.2.6 测序

跟据电泳检测结果,挑取较好的克隆菌液 200µL送到上海生工进行测序。

1.2.7 RACE技术扩增HpFeSOD全序列

1.2.7.1 RACE-PCR引物的设计和合成

BLAST比对以上测序得到的HpFeSOD部分片段序列,发现它与其他物种FeSOD同源性很高,根据所测的序列再设计正向(HpFeSOD RACE F1)、反向(HpFeSOD RACE R1)引物,用 RACE技术扩增HpFeSOD的cDNA全长。

1.2.7.2 SMART RACE cDNA的合成

RACE-PCR操作步骤参照The SMART™ RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)操作手册。

1.2.7.3 3′RACE-PCR反应体系和扩增条件

3′RACE-PCR 反应体系(50 μL)：50×Advantage 2 Polymerase Mix 1 μL;10 mmol/L dNTP Mix 1 μL;3′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL;10 μmol/L UPM 引物 5 μL;PCR-Grade Water 33.5 μL;10×Advantage 2 PCR Buffer 5μL。

5′RACE-PCR 反应体系(50 μL)：10×Advantage 2 PCR Buffer 5 μL;10 mmol/L dNTP Mix 1 μL;5′-RACE-Ready cDNA 2.5μL;10 μmol/L UPM 引物5μL;PCR-Grade Water 33.5 μL;50×Advantage 2 Polymerase Mix 1μL。

扩增程序：94℃30 s,72℃2 min,5个循环;94℃30 s,70℃30 s,72℃2 min,5个循环;94℃30 s,68℃30 s,72℃2 min28个循环;72℃10 min,1个循环;4℃保温。

1.2.7.4 RACE产物的纯化、克隆及测序

克隆、测序等方法同前。

1.2.8 序列分析

1.2.8.1 序列的网上比对与分析

将所测得的序列利用 NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上的 BLAST工具进行序列相似性及同源性查找,并利用这些序列进行同源性的比较,cDNA全长序列 ORF分析用 www.ncbi.nlm.nih.gov网站ORF finder在线分析。

1.2.8.2 氨基酸序列分析

通过在线翻译软件(http：//www.bio-soft.net/sms/)把得到的HPFeSOD序列翻译成氨基酸序列,序列分析工具(ProtParam)来分析HPFeSOD蛋白的理化特性和一级的结构。ProtScale软件来预测HPFeSOD蛋白的疏水结构,用Swiss-model构建HPFeSOD蛋白的高级结构模型。

1.2.8.3 系统发育分析

选取 GenBank中不同种类的FeSOD采用ClustalW2软件进行多序列比对分析,创建一个不同来源的FeSOD多序列的比对结果;系统发生和进化的分析在比对的基础上用MEGA 4.0[9]软件完成,系统树采用N-J方法构建。

2 结果

2.1 总RNA提取及检测

从雨生红球藻细胞中提取总 RNA,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果证实获得的总 RNA完整性较好,质量高,可以进行后续实验。

2.2 HpFeSOD特异性片段的RT-PCR扩增与鉴定

以雨生红球藻总RNA反转录后得到的cDNA第一条链为模板,以简并引物HpFeSODF1/HpFeSODR1进行RT-PCR扩增。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测获得一个片段。将该片段进行测序,长度为393 bp。登录GenBank数据库比较发现,该片段氨基酸序列与杜氏藻(Dunaliella salina)FeSOD(GenBank登录号：AAX92665)的相似为 90%,与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)FeSOD(GenBank登录号：EDP05850)的相似性为 82%,与团藻(Volvox carter f.nagariensis)FeSOD(GenBank登录号：XP_002946030)的相似性为 80%,与石莼(Ulva fasciata)FeSOD(GenBank 登录号：ABR23159)的相似性为 86%,与小球藻(Chlorella pyrenoidosa)FeSOD(GenBank登录号：ABA71697)的相似为83%,表明该片段是所要克隆的目的基因的中间片段。

2.3 HpFeSOD 3′端和 5′端的克隆

根据克隆获得的HpFeSODcDNA部分序列信息,设计合成雨生红球藻 3′和 5′RACE-PCR 特异性引物(HpFeSOD RACE F1,UPGSP-3)和(HpFeSOD RACE R1,UPGSP-5),进行RACE-PCR反应。3′RACE -PCR反应后,电泳图谱显示在1200bp的位置有一条PCR条带,5′RACE-PCR反应后,电泳图谱显示在650 bp的方位有一条 PCR条带,将条带切下并进行胶回收,克隆到 pMD18-T体中,然后筛选阳性克隆送上海生工测序。通过BLAST分析表明,该两个片段编码的氨基酸序列和已报道的FeSOD有高度的同源性,表明扩增得到的序列是HpFeSOD3′和HpFeSOD5′端的序列。

2.4 HpFeSOD全长的克隆

根据所获得的中间片段,5′端和 3′端拼接出HpFeSOD的全长cDNA序列。GenBank中HPFeSOD的序列注册编号是 JN603045,其中开放阅读框(ORF)有684个碱基组成,其编码的氨基酸有227个;5′非编码区的碱基为63个、3′非编码区的碱基为395个并含有终止密码子TAA和加尾信号。

2.5 HpFeSOD编码蛋白的生化特性分析

2.5.1 HpFeSOD编码蛋白的理化特性分析

利用 ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)工具对HPFeSOD蛋白的理化特性进行分析。在HPFeSOD的氨基酸中,其中有 23个带负电的氨基酸残基(Asp+Glu),占总数的 10.1%,编码的氨基酸为227个,24个带正电的氨基酸残基(Arg+Lys),占总数的10.6%。HPFeSOD蛋白的理论等电点为7.86,分子质量是25.5 ku,在大肠杆菌E.coil中的半衰期大于10 h,稳定系数为69.40,所以表明HPFeSOD是稳定的蛋白质。

2.5.2 HpFeSOD蛋白三级结构的预测

HPFeSOD蛋白的高级结构模型依据同源建模的预测方法用 Swiss-model[10]模型构建(图1)。HPFeSOD蛋白结构：C端区由4个螺旋的超二级结构和一个拧成三股β折叠片组成。HPFeSOD蛋白由15个卷曲、3个β折叠片、10个转角的结构和11个α螺旋组成,其蛋白结构的 N端区主要是 4个长的反平行螺旋构成。

图1 HPFeSOD空间结构预测Fig.1 The predicted dimensional structure of HPFeSOD

2.6 HpFeSOD与其他真核藻类的FeSODs多序列比对分析

利用BLASTX和CLUSTALW2分析软件对克隆得到的HpFeSOD与已报道的一些藻类的FeSODs进行同源比对分析。分析表明：序列之间的同源性比较高,在多个位点出现连续几个氨基酸一致的情况,特别是在 3个保守的氨基酸簇处(NNAAQVWNHEFFWESMK、AGLTQFGSGWAW、PILTCDMWEHAYYIDYQNRRPD)。雨生红球藻(HpFeSOD)与杜氏藻(DsFeSOD)、衣藻(CrFeSOD)、团藻(VcFeSOD)、石莼(UfFeSOD)、颤藻(OsFeSOD)蛋白的同源性为89%、83%、78%、70%、63%。不同种属的藻类的FeSOD蛋白都具有较高的同源性,表明FeSOD进化的保守性。细胞质定位的FeSODN端氨基酸的同源性高于C端(图2)。

2.7 FeSOD系统发生进化分析

作者在 Genbank上下载了 20条其他物种的FeSOD氨基酸序列,通过构建系统发生进化树来研究FeSOD与其他物种的进化关系。从系统发生进化树图谱(图3)看到：绿藻门的FeSODs聚合在一起,蓝藻门的FeSODs聚合在一起,高等植物的FeSODs聚合在一起,细菌的FeSODs聚合在一起。结果表明：不同物种的FeSOD在进化过程中是保守性,可以很好的反应各物种之间的进化距离。从系统进化树中看到雨生红球藻FeSOD和杜氏藻FeSOD在进化关系上最近,介于真菌与高等植物之间,并且真核微藻FeSOD与高等植物的FeSOD同源性高,推测雨生红球藻FeSOD在进化上可能与高等植物的进化关系较近。

3 讨论与小结

藻类中尤其是微藻由于其生长环境的特殊性经常受到高氧化环境的胁迫(比如高温,低温或是冰冻),这些不良的因素严重的影响藻类的正常生长。藻类拥有一些机制来应对逆境因子的影响并保护藻体免受不可恢复的损伤,跟藻类抗逆相关的机制有DNA修复、光保护物质、抗氧化活性系统等。研究发现,藻类在经过逆境的胁迫后,SOD会被诱导并高度表达[11]。这是因为SOD等内源性的活性氧清剂能够在逆境胁迫条件下除去过量的活性氧,从而维持机体的代谢平衡,保护细胞的膜结构,缓解植物体发生不良反应的机会,所以SOD与植物耐逆的能力有着非常大的关系[12]。

FeSOD是藻类抗逆相关基因之一,可使藻体抵抗逆境引起的氧化胁迫能力增强。目前,国内外对于藻类抗逆相关基因FeSOD的研究为数不多。Desaik等[12]的研究表明一些海洋藻类在受到紫外线照射胁迫和温度胁迫后,它们体内的MnSOD会被诱导并高度表达。Slooten等[13]蒓报道了石在受到除草剂和紫外线照射胁迫后,MnSOD和FeSOD都受到了诱导并且得到表达,不同的胁迫方式其的SOD的表达水平是不同的。Badawi等[14]的研究发现水稻FeSOD受到高度的表达可以提高其的耐冻性,还有他们也对番茄进行了抗寒能力的实验,实验结果表明如果番茄在发育期比如花期和苗期用低温胁迫一下,番茄的抗寒力能力显著提高,随之其体内的SOD的活性也显著升高,对抗寒力弱的品种进行研究发现其体内的SOD活性活性升高不大。

图2 HpFeSOD与其他真核藻类FeSOD氨基酸序列比对结果Fig.2 Multiple alignment of amino acid sequences between HPFeSOD and other weeds

本实验利用简并PCR和RACE技术从雨生红球藻中克隆了FeSOD,雨生红球藻其他抗逆相关的基因也可以通过类似的方法克隆获得,并利用生物学软件对该序列进行了氨基酸使用频率的统计、同源性比较分析、功能结构域的预测等,为微藻FeSOD的结构和特性的研究提供参考。并为进一步研究该基因的表达强度与抗逆的相关性和微藻FeSOD抗逆的分子机理奠定基础。

图3 利用邻接法构建藻类、细菌和高等植物FeSODs的系统发生进化树Fig.3 Phylogenetic tree of FeSODs constructed with the N-J method

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