辣椒根腐病拮抗细菌的筛选、鉴定及其抑菌促生作用

曲春鹤，何付丽,，刘培福，纪明山，赵长山*，高黎力

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110161；3.黑龙江省农药管理检定站 哈尔滨 150090）

由于蔬菜栽培面积不断增加，加之高密度栽培、长期连作，致使土传病害发生越来越严重。由 腐 皮 镰 孢 菌（Fusarium.solani（Mart.）App.et Wollenw）侵染引起的辣椒根腐病是一种典型土传病害，部分地区由于该病的危害，轻者辣椒减产20%～30%，重者达50%以上甚至绝产[1-2]。目前对土传病害主要防治方法是杀菌谱广、见效快的化学药剂防治，但病原菌极易对其产生抗药性，导致化学农药施用量不断增加，造成农药残留量增大、生态平衡易被破坏，威胁人类健康和安全[3-5]。因此，寻找新药剂或更有效的途径防治土传病害尤为重要。筛选对病原菌有拮抗作用的细菌、真菌、放线菌等微生物，是采用生物防治手段控制土传病害的有效途径，国内外学者致力于生防微生物筛选[6-8]及其产物研究[9-11]。然而，不当的分离筛选方法会带来巨大的工作量[12]，且筛选菌株应用到田间防病效果差甚至无效[13-15]。

本文采用平板对峙试验-胚根试验-盆栽试验系统筛选方法，以F.solani为指示菌，从辣椒根际土壤中筛选拮抗细菌，选取其中一株拮抗细菌研究其对多种病原真菌的抑菌效果及其对辣椒的促生作用，并研究其生物学特性及分类学地位。以期为快速、有效从土壤中筛选拮抗细菌提供研究方法，并为该菌株在农业生产中推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

辣椒根腐病菌（F.solani），由东北农业大学病理实验室提供；大豆疫病菌（Phytophthora sojae）、大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotinorum），由东北农业大学大豆研究所提供；黄瓜枯萎病菌（F.oxysporum）、黄瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae），由沈阳农业大学植物保护学院提供；水稻恶苗病菌（F.moniliforme），由黑龙江省八一农垦大学提供。

1.1.2 供试土壤

辣椒根际土壤，采自黑龙江省哈尔滨、牡丹江、肇东辣椒主要种植区。

1.1.3 供试培养基及试剂

①PDA培养基：用于病原真菌培养、细菌分离。马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000mL，pH自然；

②NA培养基：用于细菌纯化、培养。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2；

③NB培养基：用于细菌培养。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2；

④LB培养基：用于细菌培养。胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g。NaCl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.2。

⑤谷子：在胚根试验、盆栽试验中用于培养病原真菌。

⑥Ringer's溶液：用于配置拮抗细菌悬浮液。NaCl 6.5 g，NaHCO30.2 g，KCl 0.14 g，NaH2PO40.01 g，CaCl20.12 g，蒸馏水1000mL。

1.2 方法

采用直接分离法从辣椒根际土壤中分离细菌；平板对峙-胚根试验-盆栽试验系统筛选方法筛选拮抗细菌。

1.2.1 土壤中拮抗细菌的分离

采用直接分离法，将病原菌（F.solani）孢子悬浮液与土壤悬浮液各0.1mL涂布在PDA平板上，适温培养。待细菌菌落与病原菌长出，观察细菌菌落周围是否产生抑菌圈，挑选产生抑菌圈的细菌分离、纯化，保存备用。

1.2.2 拮抗细菌的筛选

采用平板对峙试验初步筛选拮抗细菌[16]。

经煮熟灭菌的谷子作为病原菌（F.solani）的培养基，接种培养后备用。

采用盆栽试验筛选拮抗细菌，辣椒育苗至4对真叶，移栽。处理组：在蛭石中混拌接种病原菌（F.solani）的谷子，每盆加入20mL拮抗菌菌悬液（108cfu·mL-1）。对照组：（a）盆栽混入接种病原菌（F.solani）的谷子，（b）盆栽混入无菌谷子；对照每钵加入20mL释释4倍的无菌Ringer's溶液。每处理5次重复。4周后，调查辣椒发病情况。

根据0～9级分级标准计算辣椒根腐病病情指数[17]，评价病害严重度。0级-无病；1级-根系稍有变色；3级-根系明显变褐；5级-变色根系占全部根系的30.1%～50%，植株萎蔫；7级-变色根系占全部根系的50.1%～80%，植株明显萎蔫；9级-全株死亡。

1.2.3 拮抗细菌对病原真菌生长的影响

采用平板对峙法，以土传病害病原真菌大豆疫病菌（Phytophthora sojae）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、黄瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotinorum）、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）、水稻恶苗病菌（Fusarium moniliforme）、辣椒根腐病菌（Fusarium.solani）作为指示菌，接种至PDA平板中央，在病原菌周围等距离三点接种拮抗细菌。测定拮抗细菌D221对以上病原真菌的抑菌作用。计算抑制率。

式中，r-病原菌菌落中心至拮抗细菌菌落方向的病原菌菌带宽度（cm），R-反方向的病原菌菌带最大宽度（cm）。

1.2.4 拮抗细菌对辣椒促生作用的研究

辣椒种子消毒、浸种，催芽至露白，摆放培养皿中，加入拮抗细菌悬浮液（108cfu·mL-1）。对照每皿加入等量稀释4倍的无菌Ringer's溶液。每个处理5次重复。28℃恒温培养箱培养2 d，测量辣椒胚根长度，计算增长率。

我记得在那天的开学典礼上，时任北大副校长的岳素兰教授发表了致辞，嘱咐我们珍惜在北大的学习机会，努力提高自己，在工作中学以致用，更好地为北大、为社会服务。

1.2.5 拮抗细菌的鉴定

拮抗细菌菌株参照钱存柔等[18]，车秀珠等[19]方法进行革兰氏染色、芽胞染色，在显微镜下作菌体形态观察和描述；进行硝酸盐还原试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖氧化发酵、淀粉水解、明胶液化及甲基红试验等生理生化鉴定。

以拮抗细菌的LB培养液，采用天根公司细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱式DP302-02）提取基因组DNA。以引物（KO15'AGAGTTTGATCM TGGCTCAG 3'，KO25'TACGGYTACCTTGTTACG ACTT 3'）进行PCR扩增。16S rDNA测序工作由上海基康生物技术有限公司完成，通过NCBI的BLAST程序进行比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。采用Mega 4.1软件建立系统发育树。

1.2.6 数据分析方法

数据处理采用DPS 10.15企业版软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的筛选结果

从辣椒根际土壤直接分离得到105株能够产生抑菌圈的细菌，纯化后由平板对峙试验筛选得到明显抑制病原菌（F.solani）生长的23株细菌。进一步采用胚根试验筛选得到11株细菌，经处理的辣椒胚根发病程度均较低，最低发病率为25%，明显低于病原菌处理的发病率（100%）。

11株拮抗细菌进一步进行盆栽试验。结果表明，只接种病原菌（F.solani）的辣椒植株生长明显受到抑制，且须根全部腐烂，茎基部及主根上也有明显褐色病斑，发病严重的植株死亡。与只接种病原菌（F.solani）的对照比较，分别经拮抗细菌D221、II621、15-1-1、19-2-3处理的辣椒植株在试验中发病程度较低，植株根部未发病或发病较轻，生长并未受到明显的抑制作用（见表1）。

表1 盆栽试验筛选拮抗细菌Table1 Screening antagonistic bacteria with pot experiment

由表1可知，拮抗细菌D221、II621、15-1-1、19-2-3对辣椒根腐病的防治效果分别达到70.33%、69.19%、68.43%和76.01%，即该4株拮抗细菌均能明显抑制辣椒根腐病菌对辣椒的侵染，并显著降低病害发生程度。

2.2 拮抗细菌D221对病原真菌的抑制作用

从筛选结果中选取菌株D221进行研究。采用平板对峙法，测定其对多种病原真菌的抑菌作用，结果如表2所示，拮抗细菌D221对供试的病原真菌抑制率均在50%以上，并产生明显的抑菌带，其中对大豆疫病病原菌的抑制率达67.26%。

表2 拮抗细菌D221对病原真菌的抑菌作用Table 2 Inhibition of strain D221 against different pathogens

2.3 拮抗细菌D221对辣椒胚根的促生作用

结果如表3所示，经过拮抗细菌D221处理的辣椒胚根显著伸长，与对照比较，增长34.33%，表明拮抗细菌D221对辣椒胚根具有明显促进伸长的作用。

表3 拮抗细菌D221对辣椒胚根的促生作用Table 3 Promotion of strain D221 to pepper radicle

2.4 拮抗细菌D221的鉴定

结果见表4。

表4 菌株D221的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characters of strain D221

细菌D221菌落形态乳白色，不透明，表面不光滑，菌落上有褶皱、突起，不产生色素。芽胞椭圆形。经生化鉴定为革兰氏阳性菌。具体生理生化指标见表4。

根据文献[19-20]综合分析菌株D221形态特征及生理生化特征，初步鉴定菌株D221为芽胞杆菌属的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。

将菌株D221的16S rDNA全序列在NCBI上通过BLAST程序进行同源性分析，结果表明，与菌株D221核苷酸序列相似性较高的菌株主要是枯草芽胞杆菌（Bacillus stubtilis）、解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、Bacillus velezensis以及一些未确定的芽胞杆菌（Bacillus sp.）等。选取与菌株D221的16S rDNA序列相似性较大的菌株，通过Mega 4.1进行多序比对，建立系统发育树（见图1）。

图1 菌株D22116S rDNA序列的系统发育树状图Fig.1 Phylogenetic tree of strain D221 by 16S rDNA sequence

进一步确定其分类学地位为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。菌株D221的序列已在GenBank中注册，序列号为JF495161。

3 讨论与结论

通过直接分离方法从辣椒根际土壤中分离得到105株细菌，经平板对峙试验-胚根试验-盆栽试验系统筛选方法，筛选得到4株对病原菌（F.solani）生长有明显抑制作用、能显著降低辣椒根腐病发病程度的拮抗细菌，分别命名为菌株D221、II621、15-1-1、19-2-3。

菌株D221对供试病原真菌均有明显的抑制作用；能够显著促进辣椒胚根伸长，胚根增长34.33%。经形态、生理生化特征及16S rDNA同源性比较分析，将菌株D221鉴定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。

目前关于土壤中拮抗细菌的分离筛选多采用稀释平板法[21]及平板对峙法。采用稀释平板法分离细菌，由于土壤悬浮液涂布平板培养后挑取菌落时缺乏针对性，分离得到大量细菌菌株，为进一步筛选带来巨大的工作量。平板对峙法是一种实验室无菌操作的离体试验，仅通过该方法筛选拮抗细菌，选取平板上抑菌作用最好的菌株作为筛选结果，由此得到的菌株在田间实际应用防病作用不明显，甚至无效[14-15,22-23]，或漏筛某些防病效果稳定、高效的菌株[24]。研究表明，环境条件（土壤类型、土壤质地、土壤温度、土壤湿度、pH等理化性质，气温、光照及降雨量等）及土壤中微生物种群甚至作物种类等，均会影响拮抗细菌的定殖能力、生存繁殖能力、存活率、与病原菌竞争的能力或抗菌物质产生的能力而影响其防治效果。因此，分离筛选方法的选择与建立应全面考虑寄主、拮抗细菌、病原菌及环境之间的相互作用，针对性强、相对简化。本研究采用直接分离法从辣椒根际土壤中分离细菌，针对性强，减少了分离及进一步筛选的工作量。应用平板对峙试验-胚根试验-盆栽试验系统筛选方法，首先由平板对峙试验筛选对病原菌具有一定拮抗作用的23株细菌；将以上菌株进行胚根试验，得到能够显著控制胚根发病的11株拮抗细菌，虽然辣椒胚根易感病，不易操作，但能够初步指示待选菌株是否具有防病作用，为下阶段的盆栽试验节省工作量；进一步进行盆栽试验，筛选得到4株拮抗细菌能够有效防治辣椒根腐病，盆栽筛选试验中防效最高的菌株19-2-3在平板对峙试验中的抑菌测定结果并不是最好，表明平板对峙试验仅能证明离体试验条件下的抑菌作用，并不代表实际应用的防病效果；盆栽试验处理与实际应用条件相近，筛选的菌株在田间应用效果更稳定。该系统的筛选方法充分考虑了寄主植物、拮抗细菌、病原菌及环境之间的相互作用，逐步进行，能够更加准确的筛选拮抗细菌，并使菌株更具有田间实际应用价值；菌株19-2-3在平板对峙试验及盆栽试验中表现不一致，其实际应用的适应性更强或产生更有效的抑菌物质提高其防病效果，此问题有待进一步研究。

为有效合理利用菌株D221控制病害，有必要深入研究其在田间实际应用效果、抑菌防病机理，以及与其他生防因子的复配，进一步提高抑菌效价，为其在农业生产中的推广应用及对土传病害的有效生物防治奠定研究基础。

[1] 刘丽云,刘晓林,刘志恒,等.辣椒根腐病生物学特性研究[J].沈阳农业大学学报,2007,38(1):54-58.

[2] 刘丽云.辣椒根腐病侵染规律初步研究[J].中国植保导刊,2008(28):25-26.

[3] 王玉梅,祁红英,郭建华.植物土传病害的微生物防治研究进展[J].世界农业,2008,13(1):37-39.

[4] 吕跃冬,王勇,张文革,等.绿色木霉·烯酰吗啉水分散片剂防治黄瓜枯萎病及作用机理初探[J].湖北农业科学,2006,47(9):1035-1037.

[5] 李刚,文景芝,吴凤芝,等.连作条件下设施黄瓜根际微生物种群结构及数量消长[J].东北农业大学学报,2006,37(4):444-448.

[6] Heungens K,Parke J L.Postinfection biological control of oomycete pathogens of pea by Burkholderia cepacia AMMDR1[J].Phytopathology,2001,91:383-391.

[7] Saligkarias ID,Gravanis F T,Epton H A S.Biological control of Botrytis cinerea on tomato plants by the use of epiphytic yeasts Candida guilliermondii strains 101 and US 7 and Candida oleophila strain I-182:I.in vivo studies[J].Biological control,2002,25:143-150.

[8] 何红,蔡学清,洪永聪,等.辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选[J].中国生物防治,2002,18(4):171-175.

[9] Niranjan R S,Deepak S A,Basavaraju P,et al.Comparative performance of formulations of plant growth-promoting rhizobacteria in growth promotion and suppression of downy mildew in pearl millet[J].Crop Prot,2003,22:579-588.

[10] Estevez-de-Jensen C,Percich J A,Graham P H.Integrated management strategies of bean root ot with Bacillus subtilis and Rhizobium in Minnesota[J].Field Crops Res,2002,74:107-115.

[11] 戴晓燕,关桂兰.两株对辣椒疫霉菌有拮抗作用的拮抗菌分泌蛋白的研究[J].中国生物防治,1999,15(2):81-84.

[12] 吕娟,邓小叶,郑服丛,等.一种从土壤中筛选病原真菌生防细菌的新方法初步研究[J].广西农业科学,2009,40(3):262-265.

[13] Zheng X Y,Sinclair J B.The effects of traits of Bacillus megaterium on seed and root colonization and their correlation with the suppression of rhizoctonia root rot of soybean[J].Biocontrol,2000,45:223-243.

[14] Kloepper JW.Development of in vivo assays for prescreening antagonists of Rhizoctonis solani on cotton[J].Phytopathology,1991,81:1006-1013.

[15] Gerhardson B.Biological substitutes for pesticides[J].Trends Biotechnol,2002,20:338-343.

[16] Idris H A,Labuschagne N,Korsten L.Screening rhizobacteria for biological control of Fusarium root and crown rot of sorghum in Ethiopia[J].Biological Control,2007,40:97-106.

[17] 李林,齐军山,李长松,等.主要辣椒品种对疫病、根腐病的抗性鉴定[J].山东农业科学,2001(2):29-30.

[18] 钱存柔,黄仪秀.微生物学实验教程[M].北京:北京大学出版社,2008:23-33,113-129.

[19] 车秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:44-63,364-379.

[20] 布坎南R E,吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京:科学出版社,1984：729-734.

[21] 崔正忠,肖玉珍,付建政.检测孢子菌类稀释平板改进法的研究初报[J].东北农业大学学报,2000,31(1):32-35.

[22] Williams G E,Asher M J C.Selection of rhizobacteria for the control of Pythium ultimum and Aphanomyces cochlioides on sugarbeet seedlings[J].Crop Prot,1996,15:479-486.

[23] Inam-ul-Haq M,Javed N,Ahmad R,etal.Evaluation of different strains of Pseudomonas fluorescens for the biocontrol of Fusarium wilt chickpea[J].Pakistan Journal of Plant Pathology,2003,2(1):65-74.

[24] Kim H S,Sang M K,Jeun Y C,et al.Sequential selection and efficacy of antagonistic rhizobacteria for controlling phytophthora blight of pepper[J].Crop Protection,2008,.27:436-443.