寄主植物对草地螟中肠解毒酶及保护性酶活性的影响

尹 姣， 冯红林， 李克斌， 曹雅忠

（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

昆虫与植物在长期协同进化过程中形成了各种针对性的适应机制。昆虫会有目的地选择性取食不同的寄主植物，通过消化和吸收植物食料中的营养物质，并分解排泄有毒物质，才能正常地生长发育及繁殖。由于不同寄主植物的营养成分及次生代谢物质不同，昆虫取食后体内的生理生化反应亦有所不同，进而会对其生长发育产生明显影响。因此，在长期的演化过程中，昆虫在生理功能上产生了相应的适应机制，其中一系列解毒酶系的出现，是这种适应的主要方式之一［1］。

正常情况下，生物体细胞内自由基如单线态氧（1O2）、过氧化氢（H2O2）、氢氧自由基（HO·）等的产生与清除是在超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）3种酶协调一致，处于一种动态平衡状态，使自由基维持在一个低水平，从而防止自由基毒害，一旦这种平衡受到破坏，就可能产生伤害作用［2］。因此，Fridovich把以上3种酶统称为保护酶系统［3］。保护酶系统的形成是昆虫在进化过程中逐步形成的抵抗外源刺激物和不良因素影响的有效途径。

草地螟（Loxostege sticticalis L．）是在我国东北、华北和西北地区严重发生的多食性害虫之一，可严重为害大豆、甜菜、苜蓿、向日葵等作物及牧草，对农牧业生产造成了很大威胁。草地螟具有广泛的寄主范围，同时对其寄主植物又有一定的选择性，这在其生物学记载中已有相应研究报道［4－7］，研究发现草地螟的寄主植物可分为适宜寄主植物和非适宜寄主植物，草地螟幼虫在3龄以前对寄主植物的专化性要求较高，但老龄幼虫却存在明显的转主为害习性，取食非适宜寄主植物亦可发育、繁殖，表明老龄幼虫体内对于非适宜寄主存在一定的适应机制［8－9］。目前有关不同寄主植物对昆虫体内解毒酶的影响作用已经进行了较广泛研究［10－17］，但是草地螟对不同寄主植物的生理适应机制仍然缺乏系统研究，尤其老龄幼虫取食寄主范围扩大的内在机理尚不够清晰。因此，作者利用5种不同寄主植物饲养草地螟4龄幼虫，探讨了草地螟老龄幼虫中肠酶系对不同寄主植物的反应变化，为阐明草地螟老龄幼虫对不同寄主植物生理适应机理奠定基础，进而为解析草地螟与寄主植物之间的相互关系以及在长期进化过程中的适应性对策提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 虫源及饲养条件

虫源来自内蒙古乌兰浩特市郊采集的越冬代蛹，经室内饲养繁殖后作为试验材料。羽化后的草地螟成虫用5%的葡萄糖水饲养；卵孵化后幼虫用藜（Chenopodium album L．，俗名灰菜）饲养至4龄。成虫和幼虫的饲养条件为（22±1）℃，L16∥D8，RH 70%～80%。

1．2 寄主植物

试验所用植物材料分别选取适宜寄主藜、向日葵、大豆和非适宜寄主玉米、马铃薯5种植物的幼苗叶片，其中向日葵、大豆、玉米、马铃薯在北京郊区的中国农科院植保所试验田种植，藜采自试验田内和周边的自生植株。试验前用蒸馏水冲掉各试验植物叶面的异物，晾干后饲喂试虫。

1．3 寄主植物对草地螟幼虫中肠解毒酶的影响

1．3．1 酶液的制备

每种材料加入1．5 mL预冷的相应的酶缓冲液，羧酸酯酶用0．04 mol／L、p H7．0的PBS提取；乙酰胆碱酯酶用0．1 mol／L、p H7．4的PBS提取。材料在冰浴中匀浆，匀浆12 000 g，10 min，取上清液作为酶液。

1．3．2 羧酸酯酶（Car E）活性测定

参考Van Asperen的方法［18］，并加以改进。取3．6 mLα－乙酸萘酯（α－NA），0．1 mL酶液混匀后，置30℃水浴15 min后，加1 mL DBLS试剂（1% 固蓝B与5% 十二烷基硫酸钠以2∶5混合），反应15 min后，于600 n m波长测吸光值。

α－乙酸萘酯贮液配制方法：取5．58 mgα－乙酸萘酯，8．25 mg毒扁豆碱，1 mL丙酮溶于0．04 mol／L、p H7．0的PBS中，并在100 mL容量瓶中定容制成α－乙酸萘酯贮液。

1．3．3 谷胱甘肽S－转移酶活力测定

参照Boot h方法［19］。反应混合液含0．1 mL酶液，2．9 mL 0．1 mol／L 的 磷 酸 缓 冲 液 （p H 8．0），0．7 mL 0．03 mol／L的谷胱甘肽液，50μL 0．1 mol／L的CDNB液，在25℃水浴中反应30 min，加热使其失活，在350 n m比色。

1．3．4 乙酰胆碱酯酶（Ach E）活力测定

参照Ell man方法［20］。反应混合液含有50μL酶液，2．8 mL 0．1 mol／L的磷酸缓冲液（p H 8．0），50μL 0．075 mol／L的碘化乙酰胆碱，0．1 mL 0．01 mol／L的DTNB液，在25℃水浴中保温15 min，加入0．1 mL 10－3mol／L毒扁豆碱。410 n m 处比色。用谷胱甘肽作标准曲线。

1．3．5 蛋白含量测定

参照 Bradfor d的方法［21］，取0．1 mL 酶液与5 mL考马斯亮蓝G250混匀，测定各酶液中可溶性蛋白含量，以牛血清蛋白制作标准曲线。

1．4 寄主植物对草地螟幼虫中肠保护酶的影响

草地螟幼虫取食不同寄主植物后中肠超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活力测定按南京建成生物工程研究所生产的SOD、CAT和POD试剂盒说明进行。

1．5 数据分析

应用SAS软件对试验数据进行分析，用Duncan氏多重比较进行处理间的差异显著性检验。

2 结果与分析

2．1 不同寄主植物对草地螟幼虫中肠解毒酶的影响

2．1．1 寄主植物对草地螟中肠羧酸酯酶的影响

试验结果表明，取食不同寄主植物会显著影响草地螟幼虫中肠羧酸酯酶活力（图1）。其中，取食藜时中肠羧酸酯酶活力最高，显著高于取食其他寄主植物时羧酸酯酶活力。同时，随着取食时间的延长，羧酸酯酶活力明显增加，其中，取食非适宜寄主植物（如马铃薯、玉米）比适宜寄主的羧酸酯酶（藜、大豆）活力增加迅速。尽管取食非适宜寄主植物能够显著刺激羧酸酯酶活力的增加，但是取食适宜寄主植物时中肠羧酸酯酶活力一直显著高于取食非适宜寄主植物时的羧酸酯酶活力，说明取食适宜寄主植物会在短期内刺激羧酸酯酶的快速增加，随着取食时间的延长，羧酸酯酶活力不再显著变化；取食非适宜寄主植物则会在较长时间内刺激幼虫中肠内羧酸酯酶活力的改变，可能是草地螟幼虫对于非适宜寄主植物的一种适应机制。

图1 取食不同寄主植物后草地螟幼虫体内羧酸酯酶活力的时序变化

2．1．2 寄主植物对草地螟中肠谷胱甘肽S－转移酶的影响

取食不同寄主植物对草地螟中肠谷胱甘肽S－转移酶活力会产生显著影响（图2）。在取食时间较短时，取食藜的幼虫中肠酶活力显著高于取食其他寄主植物的酶活力，但是，随着取食时间的延长，取食藜的幼虫体内谷胱甘肽S－转移酶活力变化不大，但是取食另外4种寄主植物时幼虫中肠的谷胱甘肽S－转移酶活力具有非常显著的变化，到24 h时取食5种不同寄主植物的中肠谷胱甘肽S－转移酶活力已经不再具有显著差异。

图2 取食不同寄主植物后草地螟幼虫体内谷胱甘肽S－转移酶活力的时序变化

2．1．3 寄主植物对草地螟中肠乙酰胆碱酯酶的影响

取食不同寄主植物后草地螟幼虫中肠的乙酰胆碱酯酶活力具有显著差异（图3）。在取食时间较短时（如6 h），草地螟幼虫中肠乙酰胆碱酯酶活力无显著差异。但是，随着取食时间的延长，取食适宜寄主后中肠的乙酰胆碱酯酶活力增长显著高于取食非适宜寄主植物后的中肠酶活力，取食96 h后，取食适宜寄主植物后的中肠乙酰胆碱酯酶活力比6 h时增加了6～8倍，而取食非适宜寄主植物时则酶活力变化不大，说明适宜寄主植物可以刺激幼虫中肠内乙酰胆碱酯酶活力。

图3 取食寄主植物不同时间后草地螟幼虫体内乙酰胆碱酯酶活力的变化

由图1～3可以看出，寄主植物对于幼虫中肠的解毒酶影响显著，取食适宜寄主植物时酶活力较高，但是随着取食时间的延长，取食非适宜寄主植物的羧酸酯酶和谷胱甘肽S－转移酶的酶活力也会逐渐增加，表明取食适宜寄主植物时可刺激草地螟幼虫解毒酶活力立即升高，而非适宜寄主植物长时间的刺激可以引起部分解毒酶的快速增加。

2．2 不同寄主植物对草地螟幼虫中肠保护酶的影响

2．2．1 寄主植物对草地螟中肠超氧化物歧化酶的影响

图4显示，取食初期（6、12、24 h），取食不同寄主植物的幼虫中肠SOD活力差异显著，其中取食藜、大豆和马铃薯时SOD活力较高。但是随着取食时间的延长，酶活力不再具有显著差异，表明不同寄主植物可以明显刺激草地螟幼虫中肠超氧化物歧化酶活力变化。

图4 取食寄主植物不同时间后草地螟幼虫体内超氧化物歧化酶活力的变化

2．2．2 寄主植物对草地螟中肠过氧化氢酶的影响

图5显示，取食不同寄主植物对草地螟中肠CAT活力有一定影响，其中取食马铃薯48 h时酶活力较高，但是随着取食时间的延长，取食不同寄主植物的CAT活力逐渐趋于一致。

图5 取食寄主植物不同时间后草地螟幼虫体内过氧化氢酶活力的变化

2．2．3 寄主植物对草地螟中肠组织过氧化物酶的影响

取食不同寄主植物对草地螟中肠过氧化物酶产生一定的影响（图6），除马铃薯之外，取食其他寄主植物随取食时间的延长变化幅度不大。

图6 取食寄主植物不同时间后草地螟幼虫体内组织过氧化物酶活力的变化

从图4～6可以看出，尽管在取食初期不同寄主植物会对幼虫中肠不同的保护酶产生影响，但是随着取食时间的延长，取食不同寄主植物的草地螟其中肠保护酶活力趋于一致，相互间不再具有显著差异。

3 讨论

羧酸酯酶、谷胱甘肽－S－转移酶和乙酰胆碱酯酶等是昆虫体内重要的解毒酶，对分解外源毒物、维持正常生理代谢起重要作用。其中谷胱甘肽－S－转移酶主要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的［22］。已有研究表明，虎凤蝶（Papilio glaucus）、月尾大蚕蛾（Actias l una）、棉蚜（Aphis gossypii）、小菜蛾（Pl utell a xylostella）、绣线菊蚜（Aphis citricol a）、棉铃虫（Helicover pa ar miger a）、南美斑潜蝇（Liriomyza huidobrensis）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、豆荚野螟（Mar uca testulalis）、斜纹夜蛾（Spodoptera litur a）等昆虫取食不同寄主植物时其体内各种解毒酶活性也不同［10－17，23－25］。 本 文 研 究 结 果 亦 表 明 草 地 螟 幼 虫 取食不同寄主植物对中肠解毒酶羧酸酯酶、谷胱甘肽S－转移酶和乙酰胆碱酯酶活性产生显著影响。比较取食适宜寄主与非适宜寄主的幼虫中肠解毒酶活性差异发现，其相互间酶活力不仅存在量的差异，而且存在质的差异，相对而言，较短时间内，取食适宜寄主植物时中肠解毒酶活力较高，但是随着取食时间的延长，取食非适宜寄主的幼虫中肠酶活力快速上升，96 h后酶活力可增加3～7倍，从而缩小取食不同寄主植物的幼虫中肠解毒酶活力的差值。分析中肠解毒酶活力的这种适应性变化，推测可能是由于草地螟老龄幼虫取食量暴增，仅靠适宜寄主无法满足种群生存的需要，因而需要扩展取食范围，不断试探取食非适宜寄主，而非适宜寄主植物对中肠解毒酶系不断产生刺激，在长期进化过程中诱导其对非适宜寄主产生了适应性，这种诱导是长期积累的结果，也需要一定时间的刺激才能获得，所以草地螟幼虫在取食非适宜寄主一定时间后酶活力会显著升高。但是，由于不同寄主植物次生物质种类和含量不同，所以刺激中肠产生的解毒酶含量和种类也不尽相同，从而幼虫对不同寄主植物的适应程度也各不相同，与原来的试验结果相符［8］。另外，非适宜寄主植物对中肠乙酰胆碱酯酶活力改变不大，表明寄主植物仅对部分中肠解毒酶具有明显的刺激作用。总之，这是昆虫在进化过程中对食物代谢途径的适应性调整，另外可满足解毒和节省能源两种需要。

目前已有试验表明实验昆虫体内存在的过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性和昆虫对外界刺激物相应强度的反应有关［26－30］。超氧物歧化酶（SOD）虽然是生物细胞内最重要的清除自由基的酶，但其清除O2而成H2O2后，H2O2与O2形成毒性更强的HO·必须由过氧化氢酶和过氧化物酶来分解H2O2，所以CAT和POD两种酶在生命系统的保护作用上显得更为重要。本文研究结果表明草地螟幼虫取食不同寄主植物后对中肠保护酶SOD、CAT和POD活力均有一定影响，但是随着取食时间的延长，不同处理之间酶活力不再具有显著差异，推测可能是取食初期，草地螟幼虫对于不同寄主植物的刺激产生了较强的反应，所以酶活力变化较大，但是随着取食时间的延长，幼虫逐步适应了不同的寄主植物从而酶活力也趋于较平稳的状态。草地螟幼虫对于不同寄主植物的这种适应性是其种群发展和延续的保证。

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