汽化过氧化氢灭菌技术及其在动物设施消毒中的应用

郁朝阳

（辛克莱工程有限公司（SKM-S2F） 上海 200120）

1 常见消毒与灭菌方法

当今在制药、实验中心及医疗卫生等行业，针对微生物的消毒和灭菌已有很多选项。下表综合描述了各种常用灭菌方法的优缺点比较。

表1 常用灭菌方法的优点和缺点

2 汽化过氧化氢灭菌技术和应用

过氧化氢，化学式为H2O2，其水溶液俗称双氧水，外观为无色透明液体，是一种强氧化剂。常用的过氧化氢浓度为30%或35%。过氧化氢灭菌可根除细菌、病毒、真菌和芽孢，是一种广谱微生物灭菌方式。

在制药行业，常用SAL（Sterility Assurance Level）即“无菌保证水平”来评价灭菌工艺效果，SAL的定义为，产品经灭菌后微生物残存的概率。SAL值越小，产品中微生物存在的概率也越小。国际上一般认定，采用湿热灭菌法的SAL值不得大于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一[1]。

灭菌设备的性能、灭菌程序的验证以及生产过程灭菌效果监控等可采用生物指示剂进行确认。仍以湿热灭菌法为例，其业内常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus Stearothermophilus）。在实际应用中，过氧化氢灭菌的灭菌效果与湿热灭菌法相当，采用同样的生物指示剂，可验证嗜热脂肪芽孢杆菌达到百万分之一的杀灭率。

过氧化氢灭菌的主要原理是生成游离的氢氧基，通过进攻细胞成分，例如脂类，蛋白质和DNA，从而破坏微生物组织[2]。

过氧化氢灭菌方法一般在室温下进行，无需额外升温。灭菌后残留过氧化氢的降解方法较易实现，催化剂也较容易获得。降解后生成产物只有水和氧气，因此对环境无害，无需额外的清洁。另外，一般认为在空气中浓度在1 ppm以内属于人员安全浓度水平。

汽化过氧化氢灭菌法是各国药典、GMP、消毒灭菌技术规范所推荐的方法，灭菌工艺已经非常成熟，重复性好，有专门的化学指示剂和生物指示剂验证过氧化氢气体分布均匀情况和无菌保证水平。目前已经广泛应用于在生物制药工厂、医疗卫生、生物实验室和动物研究实验室等诸多领域。并已在传递舱、隔离器、冻干机、生物安全柜、医疗器械、生物培养箱、气闸间和无菌实验室空间等场合成为最常用的生物净化方式之一。例如，隔离器的消毒灭菌是国内外过氧化氢技术的传统应用领域之一。根据国内冻干机厂商东富龙的数据，目前92%的隔离器用户都使用H2O2作为灭菌剂[3]。

另一个实例是用于粉针剂生产的冻干机在线灭菌。 由于1998版GMP对冻干机并不强求在线灭菌，以致目前国内在用冻干机只有10%配置了在线蒸汽灭菌（SIP）系统。随着新版GMP的实施，大量的冻干机面临无菌改造的压力。增设过氧化氢灭菌装置已成为仅次于增配湿热蒸汽灭菌的选择，并可作为后者的替代方式。

据此推论，该灭菌系统可作为中国新版GMP认证专家没有争议和认可的冷灭菌方式，随着新版GMP的颁布执行，汽化过氧化氢低温灭菌系统将在GMP 生物制品的无菌转运过程中发挥重要作用[4]。

3 主流过氧化氢灭菌技术

目前国外过氧化氢灭菌技术可分为两大阵营，分别为以英国Bioquell（倍尔科）为代表的湿法HPV （Hydrogen Peroxide Vapour）灭菌，以及美国Steris（斯泰瑞）的干法VHP （Vaporized Hydrogen Peroxide）灭菌。

3.1 Bioquell HPV技术

当过氧化氢在房间或腔体的表面形成微冷凝时达到生物消毒，这个阶段可以在显微镜下看到一个肉眼不可见的亚微米级的过氧化氢薄层，经研究证实，这个低温、无残留的过程已经在蒸汽发生阶段开始杀灭微生物。Bioquell专家认为，微冷凝的形成确保形成了微生物杀灭的最佳条件，当达到凝露点时，减少一个对数级别（1-log）微生物的时间（D值）最短。从灭菌动力学曲线（见图1）可以看到，伴随着微冷凝的形成，生物指示剂数量曲线从舒缓变得急剧下降。这意味着微生物数量陡降，灭菌效果显现。

图1 Bioquell“微冷凝”灭菌动力学曲线

Bioquell HPV技术一般经过以下过程：

（1）实现环境条件（Conditioning），取得40%左右的相对湿度和温度；

（2）进汽（Gassing），不断提升过氧化氢浓度；

（3）进气维持（Gassing Dwell），保持浓度，维持一定时间用以灭菌；

（4）通风（Aeration），从腔体内移除过氧化氢。

从图2中可见，腔体内汽化过氧化氢浓度需达到环境温度和压力下的冷凝点（露点），此时产生微冷凝，在此条件下，生物净化过程得以展开和维持。

3.2 Steris VHP技术

美国Steris公司于1980年代末最早发现低浓度气态过氧化氢灭菌的效用，是过氧化氢灭菌技术的创始者。1990年汽化过氧化氢正式通过美国EPA（美国国家环境保护局）批准，作为灭菌剂。Steris通过实验证明汽化过氧化氢，750 ～2000ppm 浓度的汽化双氧水灭菌效果等同于300000ppm浓度的液态双氧水，因此气态过氧化氢具有更好的除菌效果。

图2 Bioquell“微冷凝”净化周期示意图

Steris VHP技术一般经过以下过程：

（1）除湿（Dehumidification），降低腔体内湿度，并提升温度。

（2）实现环境条件（Conditioning），不断提升过氧化氢浓度。

（3）净化（Decontamination），保持浓度，维持一定时间用以灭菌。

（4）通风（Aeration），从腔体内移除过氧化氢。

如图3所示，干法冷凝的要点是将过氧化氢浓度控制在实际环境温度和压力条件所对应的过氧化氢冷凝点（露点）以内，此时过氧化氢维持在较高浓度的气体状态，在此条件下，生物净化过程得以展开和维持。

图3 Steris 干汽化净化周期示意图

Bioquell HPV和Steris VHP在生物制药、科研和医疗卫生行业中均得到广泛应用。尽管两者宣称的技术不同，但都是有效可行的[5]。

Bioquell HPV和Steris VHP的主要优缺点对比经整理后列于下表：

表2 Bioquell HPV和Steris VHP的主要技术对比

上述综合比较是相对的，在不同应用场合中可能会有增减出入，因而可针对不同的应用场合进行选用。

以下是笔者最近参加项目中的一些应用案例，供同行交流。

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4 应用实例

在某著名外资制药集团研发中心的动物设施配置中，其SPF动物房设施采用大面积层流罩作为屏障系统，使用四类笼具，而非IVC（独立通风笼具）方式。在屏障系统的定义方面，国内的实验动物标准较国外标准如AAALAC（国际实验动物评估和认可委员会）等有着更严格的无菌要求，但由于该研发中心所用笼具在使用环境下并不具备单独的空气过滤装置，因此对笼具和笼车均要求进行彻底的消毒灭菌处理，以确保无菌。

在设计和采购过程中，通过多方探讨和比较，最终选择了在笼车、笼具及笼底等设施清洗后随即在同一清洗机腔体内直接进行汽化过氧化氢灭菌的方案。该方案在国内未发现有任何先例，即使在国外也没有定型的产品。

目前的过氧化氢生成和循环装置大多为可移动式，可以与被灭菌设备腔体或房间通过具有高密闭性的金属软管连接，并提供体外循环，在这个方面，实际上已经具备充分的应用灵活性和兼容性。

在笼架清洗机方面，以往多数厂商的清洗机设备本身不配套热压缩空气干燥功能。清洗完的笼架或笼具从腔体取出置于滴干区放置。不过随着技术进步，现在的部分进口设备已能提供雾化喷头和压缩空气循环干燥单元，不过这两项均为可选项。因此，在清洗机结构方面，实际上也提供了实现集成的基本条件和可能性。

基于上述条件，在厂商外方技术人员的支持下，这样的集成得以顺利实现。

在我们的应用中，集成了过氧化氢灭菌系统的笼架清洗机如图4所示。在外表看来与普通的笼架清洗机并无二致，外置式过氧化氢发生装置提供预热、汽化和除湿作用，具有完整易用的控制系统和触摸屏界面。该装置可以是可移动的，也可以为固定式，通过连接软管和接头与设备相连。这也是过氧化氢灭菌的常见配置方式。

实际应用所选择的是干汽化工艺。先经过压缩空气对腔体进行循环除湿，然后进过氧化氢，通过循环和进一步除湿以到达预定过氧化氢浓度，在此浓度下维持一定时间进行净化灭菌，最后是通风排放。

在腔体内部的适当部位配设喷嘴，使汽化过氧化氢得以高效扩散和分布。可参考图5。

在灭菌后的过氧化氢催化降解方面，可通过在设备内部集成过氧化氢的催化降解装置，使残留的过氧化氢气体得以降解并可在室内排放。图6所示的排气过程示意图应用于我们的解决方案，但此图仅供参考。

图4 集成H2O2灭菌系统的笼架清洗机

图5 H2O2的喷雾汽化

对市场上的大多数清洗机供应商来说，要确保过氧化氢灭菌系统和清洗机本身的无缝集成并非易事。诚然，不管是Bioquell还是Steris的过氧化氢发生器都具有很好的配套灵活性，因此在清洗机内部配设喷雾头相对来说比较容易实现。但对于接触到过氧化氢的材质，以及清洗机腔体本身的气密性则需要严格保证。采用316L不锈钢作为腔体材质，将可以降低材质方面的风险。

对于在设备上排气单元中配设催化分解装置，由于受到设备结构的限制，往往无法轻易实现。如果限于条件无法经降解而直接排放，则建议最好是外置风机并排出屋面上方一定高度，以符合相关环保规范的要求。此排放空气管路的材质也需要优选，以避免残留的湿过氧化氢对管壁产生潜在的腐蚀，造成隐患。

对于笼架清洗机来说，其主要的职能还是针对动物房笼具和笼车的清洗。但是反过来看，如果在需要单独的清洗机，再配套单独的灭菌设备腔体，由此在投资方面，以及占用空间方面都可能成为问题。

图6 集成化的H2O2催化降解单元

在消毒灭菌后，需经过一段预定时间的排放处理。基于安全考虑，操作工可通过设备人机界面查看腔体内过氧化氢浓度是否已达到1 ppm这一安全指标以内，也可以通过设备商提供的手持式过氧化氢探测器直接检查。在确保腔体内达到安全浓度后，方可打开舱门。由于此前已进行空气干燥循环，以及排气阶段，笼车或者笼具已处于干燥状态，可直接进入洁净工作间存放。

清洗加灭菌的时间是一个值得注意的问题是。当今的笼架/笼具清洗时间往往很快，一般每一批笼具放入腔体后，所有清洗操作在十几分钟时间内可全部完成。在引入灭菌选项后无形中增加了2～3 h的初始化、灭菌及气体排放的用时。当然，如果能合理安排洗消批次，甚至可以考虑把灭菌过程在过夜时自动完成，则此矛盾显得不是很明显。

通过在笼架清洗机中增加过氧化氢消毒灭菌这一功能配置选项，无疑提升了该款笼架清洗机的价值和竞争力。从洗消工艺的高效性和清洗设备功能的高集成性方面，该应用具有一定的优势和先进性。

5 结束语

以上在论述过氧化氢灭菌主流技术的基础上，对在动物房设施笼具进行过氧化氢灭菌的案例进行了详细的介绍。基于国内屏障系统对非IVC笼具的无菌要求，实现了在笼具清洗后随即在同一腔体内通入过氧化氢进行快速灭菌的解决方案。相信在国内的动物实验中心设施建设中会有一定的适用性和参考价值。

[1] 国家食品药品监督管理局药品审评中心.注射剂无菌保证工艺研究及评价的原则要求.无菌工艺验证文献.2007，(8):14.

[2] 丁晓玥，梁 毅. 国外汽化过氧化氢（VHP）低温灭菌系统的最新动态观察与探讨[J].机电信息，2010，26(9):45-50.

[3] 史 云.汽化过氧化氢（VHP）常温灭菌系统的应用探讨[J].医药工程设计，2011，32(3):12-14.

[4] 东富龙网站http://www.tofflon.com/p31.html.

[5] Comparing and Contrasting - Barrier Isolator Decontamination Systems, by Jim Fisher and Ross A. Caputo, Pharmaceutical Technology Magazine November 2004, page 68.