电针联合丰富康复训练对脑损伤仔鼠脑皮质脑源性神经营养因子表达的影响

王风波，唐明薇，李晓捷

宫内感染(intrauterine infection)是先天性小儿脑损伤的重要因素，所导致的脑性瘫痪不仅是康复医学难题，更已成为严重的社会问题。小儿脑损伤早期治疗已是当前儿科学与康复医学界的热门课题。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在中枢神经系统的发育、损伤后修复及再生等方面均具有积极而重要的作用。电针和丰富的康复训练均已成为公认的神经康复治疗手段，无论是单纯的电针或者康复训练，均可促使中枢神经元的修复。本实验基于上述研究成果和理论基础，采用宫内感染致仔鼠先天性脑损伤模型，观察仔鼠的脑皮质BDNF阳性表达情况，进而探讨早期电针联合丰富康复训练对小儿脑损伤的积极治疗作用，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级成熟Wistar大鼠57只，其中雌性38只，雄性19只，体质量≥220 g，均由佳木斯大学实验动物中心提供。

1.2 试剂 脂多糖(血清型055∶B5，美国SIGMA公司)；羊抗兔BDNF多克隆抗体、SABC试剂盒、DAB显色液等(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 脑损伤仔鼠模型制备 制备宫内感染致先天性脑损伤仔鼠模型：雌、雄大鼠常规饲养，自由饮食，2∶1(雌∶雄)合笼，次日上午行阴道涂片检查，查到精子为妊娠第0天，孕鼠另笼饲养。将31只孕鼠按照随机数表法分为生理盐水组(n=5)和脂多糖组(n=26)。脂多糖组孕17 d时，腹腔注射脂多糖450µg/kg⋅d连续2 d，生理盐水组腹腔注射同等剂量的生理盐水。孕22 d前分娩的仔鼠为早产鼠，均予去除。仔鼠出生后，苏木精-伊红染色观察孕鼠胎盘，以大量中性粒细胞浸润为宫内感染判断标准。

1.4 分组方法 按照随机数字表法选取28只生理盐水组仔鼠为对照组，49只脂多糖组仔鼠再按照随机数表法分为非干预组28只，干预组21只。

1.5 干预方法 对照组、非干预组仔鼠均常规饲养；干预组接受丰富康复训练和电针治疗。

1.5.1 丰富康复训练 早期触摸：第2天即开始用软毛刷从头至尾匀速刷动，每次15 min，每天1次，同时予声光刺激，至第14天。丰富环境刺激：第7天起每天1次置于丰富环境中2 h，每3天改变1次环境，至第28天。康复训练：第15天起开始进行跑笼训练、转棒训练、平衡木训练，每天1次，至第28天，每次各10 min。各干预之间间隔1 h以上。

1.5.2 电针 第7天起开始电针干预，结合人与大鼠骨度类比，选取百会、曲池及足三里诸穴。具体操作：仔鼠顶骨正中定百会，桡骨近端关节外侧前方凹陷处乃曲池，膝外侧腓骨小头下约5 mm处为足三里；选用直径0.2 mm、长20 mm的针灸针，进针后觉针下沉紧即可，其中百会平刺入，各穴连接至电针仪，调连续波，频率5～10 Hz，强度以头部轻微抖动为度，约为3～5 V，每天1次，每次持续10 min，至第28天。

1.6 观察指标 对照组和非干预组仔鼠于出生后24 h各处死7只行脑皮质病理学、BDNF表达检测。各组分别于第14、21、28天各取7只行脑皮质BDNF表达检测。

脑皮质BDNF检测：采用SABC免疫组织化学染色法，阴性对照用磷酸盐缓冲液代替一抗。BDNF阳性细胞的棕黄色免疫阳性颗粒主要在胞浆和细胞膜表面分布，主干树突和近细胞膜的胞浆染色较深，细胞核处染色相对较浅。每例于脑皮质区取5张切片，每张切片在显微镜(400×)下随机取3个相互不叠加视野，计数阳性细胞，取平均值。

1.7 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以(xˉ±s)表示，两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析，非正态分布和方差不齐时，用秩和检验。

2 结果

2.1 胎盘病理检查结果及新生仔鼠脑组织病理改变

干预组和非干预组孕鼠胎盘内可见充血、水肿，大量中性粒细胞浸润；对照组孕鼠胎盘病理检测未见类似炎症反应。干预组和非干预组仔鼠脑组织疏松，核仁不清，胶质细胞大量聚集，血管扩张，并有脑室内出血等现象；对照组仔鼠脑组织结构完整，排列有序，核仁较清楚。

2.2 BDNF表达 第1天：非干预组仔鼠BDNF阳性细胞计数显著高于对照组(P<0.001)，而后各时相点，除第21天(P<0.01)外，两组间仔鼠均无显著性差异(P>0.05)；随着日龄增加，各组仔鼠BDNF阳性细胞计数逐渐增强，在第21天达到高峰(图1)，而在第28天呈现下降趋势；干预组仔鼠在各时相点BDNF阳性细胞计数均显著强于非干预组与对照组(P<0.001)。见表1。

图1 各组第21天仔鼠脑皮质BDNF表达(SABC免疫组织化学染色，400×)

表1 各组仔鼠不同时相点脑皮质BDNF阳性细胞计数情况比较

3 讨论

BDNF在中枢神经系统的发育、损伤后修复等方面所发挥的重要作用，已有广泛的研究。中枢神经系统受损后，脑组织的BDNF阳性表达主要在大脑皮层、海马、杏仁核、梨状皮层和新皮层等部位，钙离子内流和谷氨酸神经递质释放与BDNF阳性表达关系密切，使受损神经元进行芽生和突触重塑[1]。Pencea等在成年小鼠的侧脑室中融入BDNF，发现纹状体、丘脑和下丘脑等脑组织中的神经元数量显著增加，表明BDNF还可促进中枢神经细胞的新生[2]。徐晓晓等分别在缺血缺氧性脑损伤新生鼠模型制备前24 h和模型制备后立即按1 mg/kg的剂量将BDNF注入侧脑室，观察海马区TrkB和P75的表达情况，发现模型前给药组和模型后给药组新生鼠TrkB表达明显高于对照组和假手术组，模型前给药组高于模型后给药组，而P75的表达水平模型前给药组和模型后给药组明显低于对照组和假手术组，P75表达水平以模型组最高，模型前给药组低于模型后给药组，说明给予脑损伤新生大鼠BDNF进行干预，可诱导TrkB产生和抑制P75表达，阻断P75介导的凋亡，保护中枢神经系统，增强神经细胞自我保护能力，而在脑损伤发生之前即给予BDNF，效果优于损伤后干预[3]。实验证实，BDNF与TrkB相结合产生的相应效应可修复缺血性神经元损伤，促进缺血性损伤后突触的可塑性，改变中枢神经元形态，提高突触终末密度，促进轴突和树突的生长[4]。张三明等观察局灶性脑缺血大鼠脑组织BDNF的表达，发现缺血坏死区中心的BDNF阳性神经细胞缺失，半暗带区BDNF阳性神经细胞增多，BDNF水平在早期局灶性脑缺血大鼠的脑皮质、下丘脑和海马区均有增强，其中以海马区最为明显，提示脑缺血损伤后机体可通过调节自身代偿机制，促进内源性BDNF的表达，增强中枢神经元抵抗缺血性损伤的能力，促进受损神经元的修复、再生[5]。王占尧等将BDNF加入到单细胞克隆传代培养的小鼠神经干细胞，发现神经干细胞生长良好，加血清诱导分化后，显示为神经细胞和星形胶质细胞所组成，提示BDNF可促进神经干细胞向神经元分化[6]。新生大鼠脑组织BDNF阳性表达高峰在20～25日龄，脑损伤后脑组织BDNF蛋白阳性表达不仅与治疗窗一致，而且亦随着中枢神经系统的发育而相应性变化[7]。28日龄大鼠的脑发育水平约等于2周岁儿童，正常情况下，2周岁儿童的中枢神经系统即可发育到接近成熟水平，推测28日龄前的时期可能对大鼠中枢神经系统发育至关重要，此期内大鼠的脑在结构与功能上均可塑性极强，正是本实验时相点选择的主要依据。

针刺治疗脑损伤历史悠久，疗效肯定，对中枢神经系统的BDNF表达的积极作用也已有了大量的实验研究。张迪等电针干预学习记忆障碍大鼠百会、风府穴，发现电针组大鼠脑内BDNF表达明显强于模型组，并通过行为学测定提示痴呆前期大鼠电针干预后学习记忆能力有所改善[8]。王彦春等电针干预局灶性脑缺血大鼠风府穴，电针组大鼠脑皮质BDNF和TrkB表达均明显强于模型组和假手术组[9]。张向飞等电针干预脊髓全横断小鼠督脉穴位：电针、命门、中枢、悬枢，观察大脑皮质运动区BDNF和BDNFmRNA表达，结果显示电针干预组小鼠BDNF蛋白表达高于对照组，而两组间BDNF mRNA表达比较无明显差异[10]。邹伟等用“百会”透“曲鬓”头针疗法干预急性脑出血大鼠，设定造模后6 h、l d、2 d、3 d、7 d 5个时间窗，观察血肿周围脑组织BDNFmRNA的表达情况，发现各时间窗头枕组大鼠BDNFmRNA表达均显著强于模型组，且高峰期在脑出血后第2天，之后呈逐渐下降趋势[11]。王哲等眼针干预急性脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠，分别取肝区、上焦区、下焦区、肾区针刺，观察海马区BDNF表达情况，结果显示，眼针组大鼠BDNF蛋白表达及基因表达均高于模型组，并且眼针组神经功能缺损评分低于模型组[12]。

丰富康复训练不仅可促进脑损伤后中枢神经系统重塑和神经干细胞分化，对BDNF表达的影响也有了一些实验研究。李红玲等对出血性脑损伤大鼠术后第72 h开始进行运动训练，分为术后第7、14、2l、28天共4个时相点，各时相点运动训练组大鼠脑组织BDNF表达均明显高于对照组和假手术组，且随时相点呈递增趋势[13]。我们在既往的实验研究中也发现，通过对先天性脑损伤仔鼠进行早期触摸、丰富环境刺激和运动训练，干预组仔鼠脑组织BDNF阳性表达明显高于非干预组和对照组仔鼠，并且干预组仔鼠脑白质神经髓鞘平均厚度高于非干预组，提示丰富康复训练对中枢神经髓鞘的发育和修复具有积极作用[14]。

基于上述理论及研究成果，本实验采用宫内感染所致先天性脑损伤仔鼠动物模型，将电针干预与丰富康复训练有机结合起来，形成综合干预手段，观察仔鼠脑皮质BDNF的表达情况，实验结果显示，干预组仔鼠BDNF阳性表达明显高于对照组和非干预组仔鼠。目前，电针和丰富康复训练均早已是神经系统疾病康复的常规治疗手段，重要性不言而喻。本实验虽仅从脑皮质BDNF表达的角度观察和探讨电针联合丰富康复训练对先天性脑损伤的治疗意义，但考虑到BDNF对中枢神经系统的发育、修复、再生方面的重要作用，进一步证实了电针联合丰富康复训练对脑损伤有着积极的治疗价值，为小儿脑损伤治疗的临床早期运用提供了重要的实验依据。

[1]周子恩,丁文龙.脑源性神经营养因子及其在中枢神经损伤修复中的作用[J].解剖科学进展,2009,15(3):324-328.

[2]Pencea V,Bingaman KD,Wiegand SJ,et al.Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum,septum，thalamus,and hypotha1amus[J].J Neurosci,2001,21(17):6706-6717.

[3]徐晓晓,周江堡.BDNF对新生鼠缺血缺氧性脑损伤的保护作用的研究[J].重庆医科大学学报,2010,35(11):1642-1645.

[4]Kim MW,Bang MS,Han TR,et al,Exercise increased BDNF and TrkB in the contralateral hemisphere of the ischemic rat brain[J],Brain Res,2005,1052(1):16-21.

[5]张三明,鲁翔.BDNF在局部脑缺血大鼠的表达[J].江苏医药,2008,34(l0):1032-1033.

[6]王占尧,曹磊,姬西团.bFGF和BDNF对小鼠神经干细胞体外增殖分化的影响[J].中华神经外科疾病研究杂志,2010,9(5):435-437.

[7]宁晓霞,师社会,胡海涛,等.脑源性神经营养因子及其受体TrkB在大鼠新皮质的表达研究[J].陕西医学杂志,2007,36(9):1122-1124.

[8]张迪,孙阳,王丽芹.电针百会、风府穴对学习记忆障碍大鼠的认知行为及脑内BDNF的影响[J].中医药学报,2011,39(3):113-115.

[9]王彦春,梁少荣,马骏,等.电针对局灶性脑缺血模型大鼠皮层BDNF、TrkB的影响[J].中华中医药学刊,2012,30(3):358-360.

[10]张向飞,邹宇,赵娅,等.督脉电针刺激对脊髓全横断小鼠大脑皮质运动区BDNF表达的影响[J].四川大学学报(医学版),2012,43(2):250-253.

[11]邹伟,刘芳,孙晓伟.头针对急性脑出血大鼠BDNF和NGF表达的影响[J].中医药学报,2010,38(6):14-16.

[12]王哲,王守岩,王德山,等.眼针对急性脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织BDNF表达影响[J].针灸临床杂志,2011,27(7):57-60.

[13]李红玲,王马魁,任力,等.运动训练对大鼠出血性脑损伤BDNF基因及其蛋白表达的影响[J].中国康复医学杂志,2008,23(9):782-785.

[14]王风波,李晓捷,唐明薇.丰富康复训练对先天性脑损伤仔鼠脑神经髓鞘发育和修复的影响[J].中国伤残医学杂志,2011,19(9):6-9.