环境胁迫下大头芥花青素积累及其相关结构基因的表达

（西南大学园艺园林学院，重庆市蔬菜学重点实验室，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆400715）

大头芥〔Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.var.megarrhizaTsen et Lee〕为根芥的一个变种，其中红叶大头芥（以下简称红叶芥）在三峡库区长江流域栽培面积大、经济产量高。其肉质根主要做腌渍用，营养丰富、味道鲜美；其叶片可作为天然红色素提取的优质原料，具有重要的经济价值。通过对红叶芥色素的LC-MS 分析表明，红叶芥叶片中的红色素主要由矢车菊素构成（张欣，2008），矢车菊素是常见的6 种花青素之一。花青素代谢途径是类黄酮代谢的一个重要分支。花青素的生物代谢起始于苯丙氨酸，通过苯丙氨酸解氨酶PAL，查尔酮合成酶CHS，查尔酮异构酶CHI，黄烷酮-3′-羟化酶F3′H，二氢黄酮醇还原酶DFR 以及花青素合成酶ANS等关键酶参与的一系列酶促反应合成，随后经过不同的羟基化、甲基化和酰基化的修饰后转运到液泡中汇集。这些直接调控花青素形成的关键酶类主要是通过花青素生物合成途径中结构基因转录而来，所以花青素代谢途径的调控主要发生在结构基因的转录水平上，受多种转录因子在不同时间、空间上的调控，还有一些受到转录后调控（包满珠，1997；张宁 等，2008）。

花青素类色素广泛存在于葡萄、血橙、紫甘蓝、蓝莓、紫甘薯、矮牵牛等高等植物组织中，其生物合成途径现在也已经有相当深入的研究（Fabienne & Christiane，1999；Cotroneo et al.，2006；Hironori et al.，2007；Lu et al.，2009）。植物花青素生物合成主要是受到外界环境因素的影响，这些环境因素主要包括光照（光照强度、光质和光照时长等）、温度、逆境胁迫、元素缺失等，环境因素的影响使花青素合成的结构基因和调控基因表达上调或表达下调，促进或抑制花青素的合成与积累，最终使植物表现出不同的叶色或花色（Koes et al.，2005；Lepiniec et al.，2006）。目前对红叶芥花青素的研究主要集中在对其叶片花青素色素理化性质和结构的分析上，而对于红叶芥花青素合成的分子机制并没有进行系统的研究，因此，对环境胁迫下红叶芥花青素生物合成的研究具有重要的理论意义。本试验选取了花青素生物合成途径中上游和下游对花青素种类和积累量具有较大影响的CHI、DFR和ANS基因进行了研究。首次克隆得到红叶芥花青素生物合成途径中编码CHI、DFR和ANS的关键基因，并根据获得的cDNA 序列重新设计荧光实时定量RT-PCR 引物，检测模拟干旱、低温和强光等环境胁迫对CHI、DFR和ANS表达的影响，并初步分析了环境胁迫下红叶芥花青素累积与CHI、DFR和ANS表达的关系，有利于红叶芥叶片呈色机理的深入研究，对芥菜色泽育种也具有重要意义，在花青素的食品应用方面具有一定的应用潜力和研究价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为红叶大头芥，由重庆市蔬菜学重点实验室提供。

苹果为异花授粉植物，要栽植授粉树才能正常结实。授粉树要求与主栽品种的花期一致，只有花期相遇才能保证授粉；开花多，花粉量大，与主栽品种亲和性好。

1.2 环境胁迫处理

2009年11 月播种，待子叶展开后移至RXZ-300D 型人工气候箱培养。光周期为12 h 光照（光照强度200 μmol·m-2·s-1，温度22 ℃，相对湿度70%），12 h 暗培养（温度18 ℃，相对湿度65%）。在保证材料正常生长的情况下，6 片真叶时开始进行如下处理（每处理64 株，种植于64 孔穴盘，栽培基质为Klasmann-Deilmann TS1 泥炭，处理前使用Scotts General Purpose水溶性复合肥灌根）。

低温胁迫下红叶芥的花青素含量在处理24 h 时出现明显的增长，至96 h 达到最大值（图4）。

取样部位为处理后植株的第4、5 片真叶，取0.1 g 样品用于目标基因的表达分析（3 次样品重复，3 次技术重复），余下部分进行花青素含量测定（3 次试验重复）。处理前取样1 次作为对照，记为0 h。

1.3 总RNA提取及第一链cDNA 合成

花青素含量的测定参照Haskins 和Gorz 的方法（1986）进行。

1.4 CHI、DFR 和ANS 基因克隆

杭州画院作为全额拨款的公益性事业单位，彻底解决了画院发展的后顾之忧，可以全力投入到艺术创作和画院发展中去；在浙江省文化建设的标志性建筑——西湖文化广场中有了画院的展览、创作、办公和休闲活动的场所，可以安居乐业了；画师们挥洒着对国画技艺的追求，肩负着传承文艺的社会责任。近年来，围绕杭州西湖和运河申遗大事，做足“五水共导”文章，将“江河湖海溪”作为杭州美术创作重要题材，分别举办了“西溪视觉艺术展”、“三评西湖十景”美术展览、“运河春秋—全国中国画名家邀请展”、“相聚大运河 彩墨新杭州—美术作品展”、“新杭州—‘三江两岸’油画名家作品展”、“钱塘自古繁华—全国著名画家画杭州”等重大展览活动。

表1 基因克隆所用引物

1.5 实时荧光定量RT-PCR 表达分析

实时荧光定量RT-PCR 试验方法采用Livak Method（2ΔΔCt）在C1000 Thermal Cycler（Bio-Rad）上进行。以β-Actin为内参基因，样品第一链cDNA 为模板，使用TransStartGreen qPCR SuperMix（北京全式金生物技术有限公司）配制反应体系，扩增条件为：95 ℃，3 min（1 个循环）；95 ℃，20 s；57.5 ℃，20 s；72 ℃，20 s（35 个循环）。

1.6 花青素含量测定

取样品0.1 g，使用RNAisoTMPlus（Takara）和RNAiso-mate for Plant Tissue（Takara）试剂盒提取总RNA，然后用DNase I（Takara）去除gDNA，最后使用TransScriptFirst-Strand cDNA Synthesis Super Mix（北京全式金生物技术有限公司）合成第一链cDNA。

2 结果与分析

2.1 红叶芥花青素合成途径相关结构基因的克隆与分析

根据 Genbank 上已发布的芸薹属植物花青素合成途径相关结构基因的保守区域设计引物（表2），以红叶芥叶片cDNA 为模板通过PCR 方法得到CHI、DFR和ANS3 个结构基因的保守序列，序列的基本特征如表3所示。

表2 实时荧光定量RT-PCR 分析所用特异引物

表3 红叶芥CHI、DFR 和ANS 基因基本特征

（3）形态观察：采用透射电子显微镜（TEM）观察胶束粒子的形态。将TPGS-CS载药胶束溶液用水稀释后，滴至表面有支持膜的铜网上，自然晾干后，用1%磷钨酸染色，自然晾干后，送检。从图5可见，载药胶束呈球形，有清晰的核-壳结构，呈椭圆形，粒径约为160 nm。

将获得的基因片段提交NCBI、EMBL 和ExPASy 进行核苷酸和推导氨基酸同源性比对，结果显示，红叶芥中CHI、DFR和ANS基因与芸薹属植物来源的3 个结构基因具有极高的同源性。红叶芥CHI基因推导编码的氨基酸序列含有查尔酮异构酶超家族基因的保守结构域，该酶在植物体内的类黄酮合成途径中将查尔酮异构化为4，5，7-三羟黄烷酮；DFR基因推导氨基酸残基序列含有1 个Rossmann 折叠NAD（P）H/NAD（P）（+）结合位点（NADB）保守结构域，其主要功能为结合底物并进行特异的催化反应；ANS基因推导氨基酸残基序列属于Fe（Ⅱ）2-酮戊二酸双加氧酶超家族基因，其包含C 端的脯氨酰-4-羟化酶α亚基，推导得到的氨基酸残基第210～219 位为ArgE/dapE/ACY1/CPG2/yscS，家族活性位点为LGVEAHtDVS。

2.2 红叶芥花青素合成结构基因在环境胁迫下的表达及花青素含量变化

2.2.1 模拟干旱胁迫 模拟干旱胁迫处理后，DFR基因和ANS基因在72 h 时表达量剧烈上涨，在处理96 h 后DFR基因仍持续小幅增长，而ANS基因表达量减少至最大值的一半左右；CHI基因在干旱胁迫下虽有增长趋势，但变化幅度不大（图1）。

模拟干旱胁迫下红叶芥的花青素含量随着处理时间的延长也随之增加，在处理48 h 时增幅较大，此后增加缓慢（图2）。

2.2.3 强光胁迫 强光胁迫下，DFR基因与ANS基因的表达随时间延长而增加，处理后24 h 开始出现明显上涨趋势，72 h 时表达量陡增，随后增幅减小，至96 h 达到最大；CHI基因的表达极低（图5）。

设计引物（表1），以红叶芥第一链cDNA 为模板，使用ExTaqDNA Polymerase（Takara）分别扩增CHI、DFR和ANS，E.Z.N.ATMGel Extraction Kit（OMEGA）回收目的片段，将回收的片段克隆至pMD19-T Simple Vector（Takara），将菌液PCR 为阳性的重组子送至Invitrogen 测序。CHI通过引物CHI90-f 和CHI90-r 得到部分目的片段后，使用3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（Takara）得到3′端cDNA 序列。

2.2.2 低温胁迫 在8 ℃低温胁迫下，DFR基因和ANS基因的表达随着处理时间的推移持续增长，在处理48 h 时达到最大，以后小幅下降；CHI基因在整个处理过程中相对于其他两个基因表达量极低，仅在处理24 h 时表达量有所上升，随后又降至最低（图3）。

模拟干旱胁迫：光温条件不变，用10% PEG6000灌根模拟干旱胁迫。处理后12、24、48、72、96 h 各取叶片1 次。低温胁迫：光照强度、光照时长和相对湿度保持不变，光照培养与暗培养温度调整为8 ℃进行处理。处理后1、6、12、24、48、96 h 各取叶片1 次。强光胁迫：温度、光照时长、相对湿度保持不变，将光照强度提高至405 μmol·m-2·s-1进行处理。处理后3、12、24、48、72、96 h 各取叶片1 次。

桐庐县气象台7月26日9时、12时发布的短期天气预报指出:“明天晴到多云,午后局部有阵雨或雷雨,偏南风3级,气温26～38 ℃”。15时、18时发布的短期天气预报指出:“明天晴到多云,午后局部有阵雨或雷雨,雷雨时短时风雨较大,偏南风3级,气温27～38 ℃”。

图1 CHI、DFR 和ANS 基因在模拟干旱胁迫下的表达

图2 模拟干旱胁迫下花青素含量的变化

表4 模拟干旱、低温、强光胁迫下CHI、DFR、ANS 基因表达量和花青素含量的Pearson 相关性分析

图3 CHI、DFR 和ANS 基因在低温胁迫下的表达

图4 低温胁迫下花青素含量的变化

如表4所示，低温胁迫下，CHI、DFR和ANS基因表达量与花青素含量呈现极显著相关，且DFR基因和ANS基因相关性更高，基因间ANS与DFR也达到了极显著相关，而CHI基因与ANS、DFR基因的相关性较低。

如表4所示，模拟干旱胁迫下，CHI、DFR和ANS基因表达量与花青素含量的变化极显著相关，其中CHI基因与花青素含量的相关性最高。CHI、DFR和ANS基因间也呈现极显著相关，ANS基因与DFR基因相关性较其他更高。

教育教学是情感的互动交流过程；是有温度教育的具体体现；是实现全人教育的关键所在；是学生自我价值体现的关键。教育是充满人性光辉的事业，是实现人的全面发展的教育，尊重学生情惑展现的是教师专业水平，也是教育的核心要素，没有情感的教育是畸形的，也是无意义的教育，只有将情感融入教育教学全过程，在教学中传递情感是教师的职责所在，尊重学生的情感也是教育成败的关键，学生情感得不到尊重，学生就不愿意融入教学，更不可能接受知识，只有“亲其师，信其道”，教育才会高效进行。

强光胁迫下红叶芥的花青素含量从处理12 h 后开始缓慢增长，48 h 后增长变缓（图6）。

(一)上马石和银庭寺。古道通过的里湾村口有一上马峧(gǎo)，峧中有两方大石，高约1.2～1.6米，当地村民称这两方大石为王羲之的上马石；里、外湾村的村民们叫庵基岗的地方，龙皇堂村民称为银庭寺，当地村民说：“先有银庭寺，后有金庭观，古代是这样传下来的。”

如表4所示，CHI、DFR和ANS基因的表达量与花青素含量呈现极显著相关，且DFR和CHI基因与花青素含量的相关性高于ANS基因与花青素含量的相关性。DFR基因与CHI基因的表达量无显著相关。

图5 CHI、DFR 和ANS 基因在强光胁迫下的表达

图6 强光胁迫下花青素含量的变化

3 结论与讨论

存在于叶片表皮细胞中的花青素等植物次生代谢产物，在植物遇到低温、强光或干旱等逆境时大量合成，从而起到保护植物减轻损伤的作用（Holton & Cornish，1995；胡可 等，2010；Huang et al.，2010）。花青素的合成从苯丙氨酸开始，通过两类基因的调节：一类是植物共有的结构基因，他们直接编码花青素生物合成途径中的生物合成酶类，比如苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）、二氢黄酮醇还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）、花青素合成酶（anthocyanindin synthase，ANS）等，而且还通过与WD40、R2R3-MYB 和bHLH 等转录因子与结构基因启动子中相应的顺式作用元件的结合（de Vetten et al.，1997；Quattrocchio et al.，1999；Spelt et al.，2000），从而激活或者抑制花青素生物合成途径中一个或多个结构基因的表达（Ramsay & Glover，2005），最终控制花青素在时空上的变化。在结构基因中，DFR在不同品种间表达的变化存在空间转移性基因调节，其表达与CHI相协调。对DFR基因的调控通常都导致了花青素成分的改变，最终能产生新奇的叶色或花色（张剑亮，2008）。

本试验用荧光实时定量RT-PCR 分析了CHI、DFR 和ANS基因在红叶芥叶片中受环境胁迫（模拟干旱胁迫、低温和强光）诱导后的表达情况及其与花青素积累的关系。结果表明，这些基因在胁迫处理前表达量都很低甚至不表达，其中DFR和ANS基因在低温、强光胁迫处理后随着处理时间的延长表达量显著增加，而CHI基因处理后表达量极低。CHI基因虽然表达量极低，但在不同胁迫的每个处理过程中都有微量表达（可在模拟干旱胁迫的结果中观察到，CHI基因随着处理时间的延长有微量增长，其变化与干旱胁迫下花青素积累量的变化呈极显著正相关），由此推断CHI基因在红叶芥叶片花青素的合成过程中的表达不同于在强光和低温诱导条件下的调控类型，其表达可能受到其他调控机制的影响。因此，红叶芥中CHI基因在本试验设定的环境胁迫条件下与花青素的合成不显著相关，这一结果可能有以下原因：①红叶芥中CHI基因受到转录后或翻译后修饰；②查尔酮异构酶超家族基因中的其他家族基因影响了红叶芥中的花青素合成，本试验中克隆得到的CHI基因并非控制红叶芥花青素合成的查尔酮异构酶家族基因；③在没有相应调控机制的情况下，CHI基因表达量低。

在干旱胁迫下，DFR和ANS基因在胁迫初期表达量较高，处理12 h 后开始下降至很低的水平，至48 h 达到最低，此后表达量升高。可能在胁迫初期存在于花青素途径共享上游部分途径的其他次生代谢产物合成途径，比如类黄酮和原花青素的合成途径，在整个干旱胁迫的过程中，花青素途径代谢活跃，参与合成大量的花青素，这两个基因的表达很可能参与了调控红叶芥叶片花青素的生物合成（Nakatsuka et al.，2005）。

光照能够影响花青素的积累及其结构基因的表达，低温也被认为是另一个重要的因素（Boss et al.，1996；Lewis et al.，1999；Mori et al.，2005）。在本试验中，经过低温处理的红叶芥叶片花青素含量（本试验中花青素含量包括无色花青素）随着时间的延长持续增长，在经过一定时间的处理后，增长更为明显，这与DFR和ANS基因在此期间表达量的上升是一致的。经过模拟干旱胁迫和强光胁迫处理后这两个基因的表达量也具有相同的变化趋势，这说明了红叶芥中花青素的大量积累和结构基因的表达需要一定处理时间的诱导。由此可以推断，在强光或低温胁迫下DFR和ANS基因表达上调，对红叶芥叶片花青素的合成起到了重要的调控作用，这与DFR基因在埃塞俄比亚芥的叶片、洋葱鳞茎和水稻中的呈色作用相似（Marles et al.，2003；Kim et al.，2004，2005；Furukawa et al.，2007；Park et al.，2007）。DFR和ANS基因表达量的显著增长与花青素的产生有着明显的关系，这在后来的Pearson 相关性分析中也得到证实，相关性分析结果表明DFR和ANS基因表达量与花青素含量呈完全正相关，由此推断本试验中检测的DFR和ANS基因属于红叶芥花青素生物代谢途径，在强光和低温胁迫下对花青素的合成具有重要影响。另外，在强光胁迫下花青素含量与低温胁迫下花青素含量相差不大，但强光胁迫下DFR基因与ANS基因的表达量是低温胁迫下表达量的2 倍左右，在强光处理96 h 后DFR与ANS基因的表达量仍是最大值，而低温胁迫处理48 h 后DFR与ANS基因的表达量开始下降，由此推断强光和低温可能诱导了不同的调控机制。

所有面包的基本制作工艺流程是一致的，只是不同的面包品种在面团搅拌、面团发酵环节有差异，也仅仅是增加搅拌、松弛、发酵的次数。

本试验目前仅对红叶芥花青素合成途径的主要结构基因表达特性进行了初步的探讨，还没有较为全面地解释，而红叶芥叶片的呈色还受到调控基因和其他因素（辅色素、pH 值等）的影响，还有待于对调控基因以及类黄酮代谢途径中的其他基因进行进一步的分析和研究。

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