MiR-615在平行培养的神经干细胞与运动神经元的表达比较

索耀君 王春芳

（1浙江大学医学院附属儿童医院麻醉科 杭州市310003； 2山西医科大学实验动物中心 太原市030001）

微小RNA（microRNA，简称miRNA）是生物体内源长度约为20-23个核苷酸的非编码小RNA，广泛存在于各种动植物中，它通过调控蛋白质的表达谱来决定细胞分化、胚胎发育等一系列重要生命活动的进程［1－2］。miRNA主要通过与相关蛋白形成RNA诱导沉默复合体来介导转录后基因表达的调控，代表了一种新的 RNA调控方式［3－4］。近年来，miRNA在干细胞及其分化中的作用开始受到关注［5－7］。miR-615属于内含子型 miRNA，研究表明，其参与了前列腺、胰腺、皮肤等组织的肿瘤发生过程［8－10］；可以促进脾巨噬细胞的吞噬作用［11］，而其在神经细胞的表达及神经发育中的作用尚未见报道。本研究通过平行培养技术，获得了同一阶段的纯化的胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞与运动神经元，利用TaqMan MicroRNA Assay技术，检测了 miR-615在脊髓源性神经干细胞与运动神经元的表达变化，分析了miR-615在神经细胞的表达特点及其在神经干细胞定向分化中发挥的调节作用。

材料和方法

1.材 料

健康成年Wistar孕鼠购自山西医科大学实验动物中心；RPMI 1640、DMEM／F12、B27、CELLectionTM Pan Mouse IgG kit购自Invitrogen；胎牛血清购自杭州四季青；p75-NGFR抗体购自 Millipore；表 皮 生 长 因 子 （epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、神经营养因子-3（neurotrophin-3，NT-3）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）购自 R＆D Systems；poly-D-lysine和laminin购自 Sigma-Aldrich；mir-Van miRNA Isolation Kit、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan gene expression master mix、TaqMan MicroRNA Assays购自 Applied Biosystems。

2.脊 髓源性神经干细胞与运动神经元的平行培养

本实验将来源于胚胎大鼠脊髓组织的细胞悬液，首先利用免疫磁珠法分离培养脊髓运动神经元，然后将未与磁珠结合的细胞悬液用于培养神经干细胞，实现脊髓源性神经干细胞与运动神经元的平行培养，具体流程见图1。

图1 脊髓运动神经元与神经干细胞的平行培养流程图Fig.1Illustration of the parallel isolation of MNs and NSCs workflow

2.1 脊髓组织细胞悬液的制备

10%水合氯醛麻醉孕16d的 Wistar大鼠（按0.4ml／100g的用量），用75%的乙醇常规消毒孕鼠。于无菌条件下，在孕鼠腹部做倒丁字切口，暴露腹腔，小心取出胎鼠，放入预置D-Hank's液的平皿中，去除胎膜及胎盘等组织，再用预冷的D-Hank's液轻轻冲洗胎鼠2次，以去除血污。用显微器械取出胎鼠的脊髓组织，于解剖显微镜下仔细剥去脊髓外膜，在4℃预冷的D-Hank's液中用吸管缓慢吹打数次，用0.25%胰蛋白酶消化，使其分离成单细胞，加入胎牛血清终止消化，滤网过滤，收集细胞滤液于离心管中，337g离心5min，弃去上清液。用4℃预冷的含0.1%BSA 和2mmol／L EDTA 的PBS溶液（BufferⅡ）重悬细胞沉淀，制备成1×107／ml细胞悬液。

2.2 运动神经元的分离培养

参考CELLectionTM Pan Mouse IgG kit操作说明和本室已建立的方法［12］，并进行进一步的优化改进：

①培养板的准备：将24mm×24mm盖玻片高温高压消毒后放入6孔培养板孔中，将浓度为10μg／ml的poly-D-lysine和10μg／ml的laminin涂布于盖玻片上，37℃恒温箱中孵育2h，用D-Hank′s液冲洗2次后，备用。

②磁珠准备：用1ml含0.1%BSA的PBS溶液（pH7.4，BufferⅠ）洗涤25μl磁珠，25μl BufferⅠ重悬磁珠，加入低亲和力神经生长因子受体（nerve growth factor receptor，p75-NGFR）单克隆抗体（0.1μg-0.5μg），4℃轻摇孵育30min以上。

③纯化：用1ml BufferⅠ洗涤上一步骤所得的磁珠3次，以去除未与磁珠结合的抗体，再用25μl BufferⅠ重悬磁珠。然后，将细胞悬液加入其中，4℃轻摇孵育20min。将EP管置于磁力架2min，再用1ml BufferⅠ洗涤磁珠3次，将未与磁珠发生免疫结合的细胞洗脱下来（图2B－见第6页）。200μl 37℃预热的含1% 胎牛血清，1mmol／L CaCl2和4 mmol／L MgCl2的 RPMI 1640溶液（BufferⅢ）重悬有靶细胞结合的磁珠。应用磁性分选试剂盒中的DnaseⅠ将分选到的目的细胞从磁珠上酶切下来，用BufferⅢ重悬磁珠3-5次，收集所得的细胞悬液于BufferⅢ包被过的EP管中，离心。

④培养：用添加有10%FBS、2%B-27、N2、10 ng／ml NT-3、10ng／ml BDNF和1% 青霉素／链霉素的DMEM／F12特定培养基重悬离心所得的细胞沉淀，种植于预包被的内置盖玻片的6孔培养板中。37℃、5%CO2条件下培养24h。

2.3 神经干细胞的分离培养

将未与磁珠发生免疫结合的细胞洗脱液，采用已建立的神经克隆球形成技术［13］，进行神经干细胞的培养和纯化：将细胞悬液337g离心5min，用神经干细胞限定性培养液（含20ng／ml EGF、20ng／ml bFGF、2%B27的 DMEM／F12）重悬细胞沉淀，用细胞计数板在显微镜下进行细胞计数。接种4×105个细胞至盛有5ml限定性培养液的25ml培养瓶中，将培养瓶在孵箱中垂直放置，37℃、5%CO2条件下悬浮培养。每天在倒置显微镜下观察细胞分裂和增殖情况，注意悬液中神经球形成的状况，并观察神经球数目和体积的变化情况。每3d半量换液一次。

3.m iR-615的表达检测

3.1 RNA提取

采用Ambion公司的 mirVanaTM miRNA Isolation Kit提取神经干细胞和胆碱能神经元的总RNA，紫外分光光度法进行RNA浓度和纯度测定。

3.2 逆转录

采用 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit将总RNA逆转录为cDNA，逆转录反应体系为15μl中含：10ng总 RNA；3μl RT primer引物；7μl Master Mix（包含dNTP mix；Multiscribe RT enzyme；10×RT buffer；RNase Inhibitor）。在Mastercycler PCR 仪（德国 Eppendorf）上，以下列条件进行逆转录：16℃ 30min，42℃ 1h，85℃ 5 min，将所得cDNA产物于-20℃保存备用。

3.3 Real-time PCR

采 用 TaqMan miR-615Assays（Assay ID 001960）对miR-615进行相对定量。PCR扩增体系为20μl中含：10μl 2×TaqMan Gene Expression Master Mix；Real-time primer 1μl；cDNA 产 物。在ABI 7300型定量PCR仪上，以下列条件进行扩增：95℃10min，95℃15s，60℃1min，循环40次。反应设置 4 个复孔，以 4.5SrRNA（Assay ID 001716）作为内对照。

3.4 采用2－ΔΔCt比较阈值法［14］，应用 RQ Study软件（Applied Biosystems）进行 miR-615的相对定量分析。组间比较采用GraphPad Prism 5软件，进行t检验，以P＜0.05为显著性检验标准。

结 果

1.脊 髓源性神经干细胞与运动神经元的形态学特点

本文利用免疫磁珠法分离获得运动神经元，运动神经元与藕联p75-NGFR抗体的磁珠结合，从而从脊髓组织细胞悬液中分离出来，24h贴壁培养后，呈现典型的运动神经元形态，胞体大、多级、长轴突（图2A）。原代培养的神经干细胞呈圆形，悬浮生长，在神经干细胞限定性培养基中培养7d后，倒置显微镜下观察可见非神经干细胞逐渐死亡，部分细胞聚集形成由几个或几十个细胞组成的悬浮的细胞团块。原代培养14d后，出现由单个神经干细胞增殖而成的神经干细胞球（图2B）。

图2 脊髓源性神经干细胞与运动神经元的形态A.分离纯化培养24h后，运动神经元呈胞体大、多级、长轴突形态，×10。B.原代培养第14d时，形成的神经干细胞球，形态规则，轮廓清楚折光性强，×20。Fig.2The morphology of isolated spinal cord-derived neural stem cells and motor neuronsA.Phase contrast micrographs of purified MNs after 24hof culture.MNs are large and usually multipolar in form with a large axon，and multiple dendritic processes，×10.B.Neural stem cell sphere showed regular morphology with clear boundary and good refraction after culture of 14d，×20.

2.m iR-615的表达结果

TaqMan miR-615Assay定量PCR结果显示，目的miR-615和内参4.5SrRNA的PCR扩增曲线呈典型的“S”型曲线，可见该方法可特异性地扩增目的序列（图3A）。相对定量数据分析结果显示，miR-1615在培养的运动神经元中明显地高表达，是脊髓源性神经干细胞中的11.11倍，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图3B）。

图3 miR-615在脊髓源性神经干细胞与运动神经元中的表达A.Real-time PCR扩增曲线。B.相对定量结果。Fig.3Expression of miR-615in spinal cord-derived neural stem cells and motor neuronsA.Amplification curve.B.Relative quantification.T：Target miR-615

讨 论

神经干细胞向运动神经元分化的过程，是神经干细胞特性基因表达的降低或消失和运动神经元特性基因表达增加或获得的过程。发育神经生物学的研究表明，转录因子（transcription factor）在此过程中调控一部分基因的转换，但仍有某些在先前状态特定表达的基因剩余而继续发挥原有的功能［15］。miRNA作为细胞内特有的一种工具，可以同时对多个剩余靶基因进行调节，从而使基因表达产生快速彻底的转变。为了探索miRNA在脊髓源性神经干细胞向运动神经元分化过程中的分子机制，有必要直接比较脊髓源性神经干细胞与运动神经元在miRNA水平的表达差异。

为了更有效地比较脊髓源性神经干细胞与运动神经元的生物学特征差异，本实验摸索和建立了脊髓源性神经干细胞与运动神经元的平行培养技术。对来源于同一组织样品的不同细胞同时提取平行培养的方法，有助于研究细胞分化过程中的生物学特性的改变。优点在于，可以更直接地比较胚胎发育过程中神经干细胞与分化的运动神经元生物学特征的差别；其次可以降低对细胞来源样品的需求量。有研究利用密度梯度离心的方法，从同一小鼠胚胎脊髓组织中分别培养了原代运动神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞［16］。本实验结合免疫磁珠法的特异结合特点，先从大鼠脊髓组织中分离得到了纯化的运动神经元，同时，我们将分选过程中洗脱下来的未与磁珠结合的细胞用于神经干细胞的培养，使之和运动神经元来自于同一批个体，使得二者的比较更具有生物学上的统计意义，为本课题后续进行的脊髓源性神经干细胞与运动神经元间miRNA表达的比较研究奠定了坚实的基础。

定量检测miR-615表达结果显示，miR-615在分离的运动神经元中较在脊髓源性神经干细胞中显著高表达，提示miR-615可能在神经干细胞定向分化为运动神经元过程中发挥调节作用。MiR-615属于内含子型miRNA，其宿主基因为Hox蛋白家族成员之一－－HoxC5。Hox蛋白是脊髓运动神经元定性和组成的重要决定因素［17］。此外，Hox蛋白相关的miRNAs在细胞发育过程中发挥重要作用［18－19］。目前发现的内含子miRNA与宿主基因的相互作用，较多的是内含子miRNA协同其宿主基因共同完成某项生理功能［20］。MiR-615可能和其宿主基因HoxC5协同作用在神经干细胞定向诱导分化为运动神经元过程中发挥重要功能。研究表明，miR-615基因序列上游启动子区的甲基化水平调节其自身的表达，在去甲基化药物处理后，可以重新激活miR-615表达的增加［8，10］。在体外培养的神经干细胞中，干预miR-615启动子区的高甲基化状态，可以使沉默的miR-615表达上调，发挥其调节作用。

通过本研究我们认为，miR-615可能在脊髓运动神经元的成熟中发挥调节作用，在神经干细胞中通过表观遗传修饰的方法，激活miR-615的表达，可以提高神经干细胞分化为运动神经元的比例，为神经干细胞定向分化为运动神经元的诱导方案提供新的方法，其具体作用机制需要进一步的功能实验验证。

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