布地奈德吸入对哮喘气道重塑大鼠气道平滑肌细胞MMP-9及TIMP-1表达的影响

李 淼 尚云晓 魏 兵

（中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸内科，沈阳110004）

气道重塑是慢性哮喘气道的重要病例特点。气道重塑是导致气道高反应，肺功能持续性下降的主要原因，并可导致顽固性哮喘。预防和逆转气道重塑是干预哮喘，尤其是顽固性哮喘的有效途径。吸入性糖皮质激素（ICS）是哮喘治疗的一线药物，其通过减轻气道炎症，抑制免疫反应的作用来减轻气道反应，布地奈德气雾剂是目前哮喘治疗的常用药物。气道重塑的病例特点包括：气道平滑肌层肥厚／增生，杯状细胞增生肥厚，上皮下纤维化及血管增生，其中气道平滑肌层增生／肥厚在其中起到重要作用。有文献报道，糖皮质激素有抑制气道平滑肌层增厚的作用［1］，但其对ASMC作用机制报道较少，因此，本研究从细胞水平探讨了布地奈德气雾剂对ASMC 中 MMP-9／TIMP-1 作 用，以 进 一 步 说 明ICS对哮喘气道的作用。

材料和方法

1.实 验动物及材料

雌性Wistar大鼠60只，周龄6周～8周，体质量60～80g，中国医科大学中心实验室动物部提供；百日咳灭活杆菌购自北京生物制品研究所；卵蛋白及氢氧化铝凝胶购自美国Sigma公司；DMEM培养基及胎牛血清购自美国Hyclone公司；抗α－平滑肌肌动蛋白多克隆抗体购自武汉博士德公司；定量PCR试剂盒及 MMP-9／TIMP-1mRNA 引物购自美国Takara公司。

2.方 法

2.1 大鼠哮喘气道重塑模型制作方法

参照文献［2］，即1d及8d腹腔注射1%卵蛋白10mg、氢氧化铝凝胶200mg及百日咳灭活杆菌6×109／ml混合液共1ml致敏，第15d开始超声雾化吸入2%卵蛋白诱喘，隔日一次6W，模型制作共8W。

2.2 大鼠来源及分组

选择同种属、同体质量（60-80g）、饲养条件一致的雌性 Wistar大鼠共60只、随机分成以下各组。按不同的影响因素进行分组。其中正常对照组20只、模型组20只、治疗组20只。饲养期间给予正常饮食。

2.3 因素处理及取材时机

A正常对照组：用生理盐水代替卵蛋白吸入，吸入方法同模型组并同期取材。B模型组：按哮喘气道重塑模型制作方法，诱喘成功后24h内取材。在致敏后大鼠出现剧烈咳嗽、打喷嚏、呼吸困难、喘息、呼气费力或点头样呼吸、听诊闻及喘鸣音，则表明哮喘模型制作成功。C治疗组：卵蛋白吸入致敏及诱喘同模型组。自致敏第15d，每只大鼠每日在吸入致敏后用压缩雾化机面罩吸入普米克雾化溶液（2ml／1mg）、每次5min、隔日一次，共6w，诱喘后24h内取材。

2.4 HE 染色

各组大鼠分次在最后一次致敏后24h内处死，每次取材6只，每组2只，腹腔注射10%水合氯醛（30mg／kg）麻醉后，左心室取血处死大鼠。取右肺中叶组织用4%多聚甲醛固定24h后石蜡包埋，切片5μm。按照文献［1］用图像分析软件（HMIAS 2000；Qianping Systems，Wuhan，China）测量哮喘大鼠气道壁面积（Wat）及平滑肌层面积（Was），并用气道基膜周长（Pbm）进行标准化。用这种方法每张切片测量3-5个支气管，测量结果用¯x±s表示，进行统计学分析。

2.5 ASMC原代培养［3］

在肺组织取材后无菌分离大鼠气管，仔细剥离外膜，去除内膜。将气管平滑肌剪下，用含双抗的DMEM培养液清洗后，用0.1%Ⅳ型胶原酶于37℃水浴下消化30min两次，待液体浑浊时用含10%胎牛血清的DMEM终止消化。1000r／min离心后用含10%胎牛血清DMEM重悬后200目滤网过滤后37℃、5%CO2孵箱培养。3d换液，7d细胞长满培养瓶。用0.25%胰蛋白酶消化传代后，利用成纤维细胞贴壁较快的特点纯化平滑肌细胞，取第4代细胞用于检测。

2.6 ASMC鉴定

于倒置显微镜下观察，ASMC呈梭形或多角型，呈谷峰样。以抗α-actin，山羊抗兔FITC免疫荧光染色后，细胞浆呈绿色的细胞为平滑肌细胞。

2.7 MMP-9／TIMP-1mRNA含量检测

将各组大鼠ASMC速冻于液氮中保存。使用Trizol试剂盒提取总RNA，利用Takara反转录试剂盒逆转录总RNA至cDNA，逆转录体积10μl。取逆转录产物加入SYBR Master Mix、上下游引物行实时定量PCR。所有引物均由大连Takara生物工程技术服务有限公司合成，分别为大鼠 MMP-9：上游5＇-AGCCGGGAACGTATCTGGA-3＇；下 游 5＇-TGGAAACTCACACGCCAGAAG-3＇；大鼠 TIMP-1：上游5＇-CGAGACCACCTTATACCAGCGTTA -3＇；下游5＇-TGATGTGCAAATTTCCGTTCC-3＇；大 鼠 GAPDH：上 游 5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇；下游5＇-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3＇。采用 Rotor-gene 2000Realtime Amplication实时定量PCR扩增仪进行扩增。每个样本做3个平行管。反应条件均为95℃变性30s，95℃5s，60℃20s，共40个循环，标准溶解曲线分析。线性指数增殖期的CT值用来计算DNA模板的初始拷贝数。同时测量每个样本的管家基因GAPDH mRNA表达与 MMP-9／TIMP-1mRNA表达。模型组、治疗组的CT值分别与正常组CT值比较，得出相对倍数。

2.8 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。实验结果以¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析LSD或SNK法进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.H E染色

在模型组大鼠肺组织中粘膜层及粘膜下层炎症细胞较正常对照组大鼠明显增加。模型组标准化后的气道壁面积及平滑肌层面积明显较正常对照组增加，治疗组大鼠肺组织炎症细胞较模型组明显减少，但较正常对照组增多。图像分析测量各组大鼠肺支气管哮喘模型组 Wat／Pbm及 Was／Pbm明显较正常对照组增加，治疗组Wat／Pbm及Was／Pbm较正常对照组增加，但较模型组明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）（见表1，图1）。

表1 各组大鼠气道Wat／Pbm及Was／Pbm的比较（¯x±s n＝60）Table 1 the comparisons of Wat／Pbm and Was／Pbm in different group

图1 8周后各组大鼠肺组织切片观察（HE 10×）Fig.1the observation of lung tissue in different group after 8W（HE 10×）

2.R eal time PCR 检 测 各 组 大 鼠 ASMC 中MMP-9mRNA及 TIMP-1mRNA表达含量

当细胞长至融合并呈谷峰状态时进行传代。用第四代细胞作为实验对象。模型组大鼠ASMC中MMP-9mRNA表达较正常组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；但治疗组大鼠 ASMC中 MMP-9mRNA表达较模型组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；但较正常对照组大鼠ASMC增加（P＜0.05）。模型组大鼠ASMC中TIMP-1mRNA较正常组降低；但治疗组大鼠ASMC中TIMP-1mRNA较哮喘组增加，但较正常对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 Real-time PCR检测不同组ASMC中MMP-9mRNA及TIMP-1mRNA表达（¯x±s）Table 2 Real-time PCR analyses the expressions of MMP-9mRNA and TIMP-1mRNA in ASMC of different group（¯x±s）

讨 论

MMPs主要由巨噬细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞（SMCs）、内皮细胞等产生。MMP-9是MMPs基质降解蛋白酶家族中最主要的成员。正常情况下，MMP-9能够降解Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等细胞外基质 （ECM）。而 TIMP-1是MMPs的特异性抑制物，可由各种组织细胞和炎症细胞分泌，可抑制 MMP-9产生，抑制基质降解，引起基质沉积。气道重塑是气道慢性炎症的结果，包括气道壁增厚和基质沉积、胶原沉积、上皮下纤维化、平滑肌增生和肥大、肌成纤维细胞增殖及黏液腺、杯状细胞化生及增生、上皮下网状层增厚、微血管生成等病理改变。在这些病理变化中，气道平滑肌的改变被认为是导致气道高反应性和哮喘加重的重要因素之一。哮喘气道ASMC增生在哮喘气道重塑过程中起重要作用，MMP-9与哮喘气道重塑密切相关［4］。有学者通过对比TIMP-1基因敲除小鼠与野生鼠哮喘模型发现TIMP-1能够通过抑制气道反应性，调节气道炎症，抑制气道重塑及细胞因子表达起到保护气道的作用［5］。MMP及TIMP比例的平衡是维持正常基质和内环境稳定的重要因素，MMP与TIMP的分泌失衡与哮喘气道炎症，气道平滑肌增生，气道反应性增高密切相关，参与哮喘气道重塑的病理生理过程。也有学者通过地塞米松在体干预哮喘小鼠肺组织免疫组化检测发现地塞米松可通过抑制肺内MMP-9／TIMP-1的表达而减轻气道重塑［6］。本实验通过制作哮喘模型原代培养ASMC与正常大鼠比较证明 MMP-9mRNA明显增加，而TIMP-1mRNA含量明显降低，可见在哮喘时细胞水平同样发生改变。

布地奈德气雾剂是哮喘治疗常用的吸入药物之一，布地奈德能够抑制嗜酸细胞气道炎症，能够减少肥大细胞数量及减少炎症介质释放。有文献报道吸入布地奈德通过上调哮喘患儿气道巨噬细胞产生TIMP-1，下 调 MMP-8 表 达 从 而 改 善 MMP-8／TIMP-1比值改善气道重构［7］。也有文献报道，吸入糖皮质激素能下调MMP-9，上调TIMP-1的表达而改善气道重塑。但是其缺乏确切的细胞学基础。本文通过吸入布地奈德干预哮喘气道重塑大鼠模型后，通过HE染色后测量 Wat／Pbm及 Was／Pbm证明布地奈德治疗组大鼠ASMC明显较模型组降低，提示布地奈德气雾剂吸入有改善哮喘气道重塑的作用。本文还通过RT-PCR检测各组 ASMC中MMP-9及 TIMP-1含量证明治疗组 MMP-9含量较模型组明显下降，但TIMP-1较哮喘组明显增加；提示在哮喘气道 MMP-9／TIMP-1比值降低，而布地奈德吸入能明显改善气道平滑肌细胞 MMP-9／TIMP-1比值从而改善哮喘气道平滑肌层胶原沉积，减轻气道壁增厚，改善气道重塑过程［8］。这为糖皮质激素在哮喘气道重塑过程中的应用奠定了细胞学基础。

［1］朱灿红，季伟，固卫芳.吸入性糖皮质激素对哮喘气道重塑模型平滑肌的影响.江苏医药，2006，32（1）：50-51

［2］Xie M，Liu XS，Xu YJ，et al.ERK1／2Signaling Pathway Modulates the Airway Smooth Muscle Cell Phenotype in the Rat Model of Chronic Asthma.Respiration，2007，74（6）：680-690

［3］An SS，Laudadio RE，Lai J，et al.Stiffness changes in cultured airway smooth muscle cells.Am J Physiol Cell Physiol，2002，283（3）：792-801

［4］Song Y，Qi H，Wu C.Effect of 1，25-（OH）2D3（a vitamin D analogue）on passively sensitized human airway smooth muscle cells.Vespirology，2007，12（4）：486-494

［5］Sands MF，Ohtake PJ，Mahajan SD，et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase-1modulates allergic lung inflammation in murine asthma.Clin Immunol，2009，130（2）：186-198

［6］杨 远，林 勇，黄静.CpG ODN和地塞米松对哮喘气道的重塑及 MMP-9、TIMP-1表达的影响.中国病理生理杂志，2007，23（10）：1977-1981

［7］Obase Y，Rytil？ P，Metso T，et al.Effects of inhaled corticosteroids on metalloproteinase-8and tissue inhibitor of metalloproteinase-1in the airways of asthmatic children.Int Arch Allergy Immunol，2010，151（3）：247-254

［8］朱清义，孙广荣综述.基质金属蛋白酶 MMP-9及其组织抑制剂-1与哮喘气道重塑.中国现代医学杂志，2007，17（22）：2743-2747