正交超声法提取鱼腥草多糖工艺研究*

罗 馨，赵卫星，温普红

（宝鸡文理学院 化学化工系，陕西 宝鸡 721013）

鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb）又名蕺菜、侧耳根、鱼鳞草等，是三白草科（Saururaceae）蕺菜属（Houttuynia）多年生草本植物[1]，为我国传统常用药物之一。在我国仅有一种，原名“蕺”，始载于《名医别录》下品。《本草纲目》载：“其叶腥气，故俗名鱼腥草。”别名猪鼻孔、鸡儿根等。现代医学研究表明鱼腥草富含人体所需蛋白质、脂肪、钙、磷、铁及VC、VE等多种营养成分，同时还含有多糖、黄酮、挥发油类等多种药用成分，是一种“药食兼用型”的野生植物，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效[1，2]。主要用于肺脓疡、痰热咳嗽、热痢热淋、痈疮肿毒、消痈排浓、杀虫、消积、健脾、止血。广泛分布于我国南方各省区。

本研究通过单因素实验选择和正交设计法对鱼腥草中多糖进行微波提取，以鱼腥草中的多糖提取率为指标，分别对料液比、提取温度、提取时间和提取次数等因素进行考察，优化出微波法提取鱼腥草多糖的最佳条件。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

鱼腥草购于宝鸡医药大厦，95%乙醇、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、丙酮均为分析纯。

722 N型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；R-1002型旋转蒸发器（郑州长城科工贸有限公司）；2NHW-Ⅱ型电子调温电热套（巩义市予华仪器有限公司）；KQ-2200DE型数控超生清洗器（昆山市超生仪器有限公司）；800B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；101-2型电热恒温鼓风干燥箱（北京科威仪器有限公司）。

1.2 鱼腥草粗多糖的提取

鱼腥草60℃干燥后，粉碎过40目筛,精确称粉4.0g,放入500mL的烧杯中,加一定体积蒸馏水浸泡24h,在一定温度下，超声波提取一定时间，过滤，弃去残渣，超声波重复提取一定次数，合并滤液后，浓缩，再加用一定80%乙醇去脂肪，静置沉淀后，将上层悬浮物用离心机离心（4000r·min-1,30min），取出，合并沉淀，将沉淀溶于丙酮中充分洗涤静置过夜，沉淀再次用无水乙醇中充分洗涤后，静置，待沉淀完全后将沉淀物置旋转蒸发仪中加热至一定体积，经真空干燥得到鱼腥草粗多糖[3，4]。

1.3 多糖含量测定方法[5-7]

1.3.1 测定原理 苯酚-硫酸法测定多糖含量[8-9]，其基本原理是蔗糖在浓H2SO4作用下（图1），分子内脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛，它们能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在490nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定吸光度。本实验以葡萄糖做标准曲线。此法简单，试剂便宜,灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的干扰。

图1 戊糖和己糖脱水反应Fig.1 Dehydration reaction of pentose and hexose

1.3.2 标准曲线的绘制 取20mL刻度试管11支编号，按表1加入溶液和蒸馏水待测定。

表1 苯酚法测定可溶性糖绘制标准曲线的试剂量Tab.1 Drawing standard curve of the amount of reagent in detemination of soluble sugar by phenol method

然后按顺序向试管内加入1.00mL浓度为9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5～20s加入5.00 mL浓H2SO4，摇匀。比色液总体积为8.0mL，在室温下放置30min，比色，以试剂空白为参比，在490nm波长下测定吸光度A，以糖含量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归见图2。

图2 蔗糖标准曲线Fig.2 Standard curve of sucrose

回归方程为：A=0.0087C-0.0033，R2=0.9999。

1.4 多糖的测定

精确称取真空干燥恒重后的鱼腥草多糖500mg,水溶解后定容到100.0mL容量瓶中,摇匀,作为多糖储备液。精确量取多糖储备液2.00mL,定容置250.0mL量瓶中,再分别取2.00mL置25.00mL量瓶中，然后加入4%苯酚溶液1.00mL，摇匀后迅速加入7.00mL浓硫酸，定容，在室温放置30min，以相应试剂为空白对照，在490nm测定其吸收度。

2 单因素选择实验

2.1 料液比的选择

料液比（m/V）分别为 1∶10；1∶15；1∶20；1∶25；1∶30，提取温度为 70℃，提取时间均为 30min，提取3次，按照实验部分1.2方法，得到鱼腥草粗多糖，按照实验部分1.4方法测定多糖，利用标准曲线计算结果多糖提取率，结果如图3所示。

图3 料液比的影响Fig.3 Effect of material liguid

图3结果表明，随着料液比的增加，鱼腥草多糖提取率呈现先升高后降低趋势，当料液比（m/V）为1∶20时，多糖提取率最大为5.22%，当料液比增加时，提取率下降，故选料液比（m/V）为1g∶20mL。

2.2 提取温度选择

选择单因素实验2.1中的最佳料液比（m/V）为1g∶20mL，分别在 40、50、60、70、80℃ 5 个温度下提取多糖，提取时间均为30min，提取3次，按照实验部分1.2方法，得到鱼腥草粗多糖，按照实验部分1.4方法测定多糖，利用标准曲线计算结果多糖提取率，见图4。

图4 提取温度的影响Fig.4 Effect of entraction temperature

图4结果表明，随着提取温度的增加，鱼腥草多糖同样提取率呈现先升高后降低趋势，当提取温度为70℃，多糖提取率最大为5.22%，温度高于40℃多糖含量下降，分析原因可能是随着温度的升高，鱼腥草多糖开始降解以及蛋白质逐渐溶出。另外升高温度并在长时间浸提条件下可能会影响多糖的生理活性，因此，综合考虑多糖的提取量及活性等各种因素，选取70℃为适宜的提取温度。

2.3 提取时间选择

选择单因素实验2.1和2.2中的最佳料液比（m/V）为1g∶20mL和提取温度70℃，提取时间分别为 10、20、30、40、50min，提取时间均为 30min，提取3次，按照实验部分1.2方法，得到鱼腥草粗多糖，按照实验部分1.4方法测定多糖，利用标准曲线计算结果多糖提取率，结果见图5。

图5 提取时间的影响Fig.5 Effect of extraction time

由图5可见，随着提取时间的增加，鱼腥草多糖同样提取率呈现升高趋势，当提取时间30min，多糖提取率最大为5.22%，提取时间在30min后多糖含量反而下降，这说明此时大多数的多糖已经溶出并达到平衡，再延长提取时间对提取多糖不利。因此，提取鱼腥草多糖所需的适宜时间为40 min。

2.4 提取次数

选择单因素实验2.1、2.2、2.3中的最佳料液比（m/V）为 1g∶20mL、提取温度 70℃、提取时间 40 min，提取分别为1,2,3,4,5次，按照实验部分1.2方法，得到鱼腥草粗多糖，按照实验部分1.4方法测定多糖，利用标准曲线计算结果多糖提取率，结果见图6。

图6 提取次数的影响Fig.6 Effect of extraction times

图6结果表明，随着提取次数的增加，鱼腥草多糖同样提取率呈现升高趋势，当提取次数3次时，多糖提取率最大为5.22%，随着提取次数增加，多糖提取率增加不大，为节省资源，鱼腥草多糖提取次数选为3次。

3 最佳条件的确定

在单因素选择实验的基础上，多鱼腥草多糖提取的工艺条件进行了优化，采用L9（34）正交试验，选取料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）和提取次数（D）4个因素，每个因素选择3个水平，具体设计见表2，按照实验部分1.2方法，得到鱼腥草粗多糖，按照实验部分1.4方法测定多糖，结果见表3。

表2 鱼腥草多糖正交L9（34）因素及水平设计表Tab.2Polysaccharides of L9（3）4orthogonal design table of factors and levels

表3 鱼腥草多糖正交L9（34）实验结果及分析Tab.3Polysaccharides of L9（3）4orthogonal experiment results and analysis

正交试验结果（表3）表明，影响微波法提取鱼腥草多糖的主要因素依次为：提取时间（C）≈料液比（A）＞提取温度（B）＞提取次数（D），最佳组合为：A2B3C3D1，即最佳条件：料液比（m/V）为 1∶20、提取温度为80℃、提取时间为40min、提取次数为2次，优化后在此条件下重复试验，鱼腥草多糖提取率可达5.35%。

4 结论

本实验采用超声提取技术，超声作用可以破碎细胞，改变植物的组织，加速溶解有效成分，催进扩散和传质超声提取适用于多种天然植物的有效成分的提取，如生物碱，萜类化合物，黄酮化合物，脂质核挥发油等。超声提取伴随强度很大的声波的传播会出现声冲流，声空化，声辐射力以及声致发光等许多非线性过程，具有空化效应、机械效应、热效应、和化学效应等特点。保持有效成分活性的同时也减少了色素和蛋白质等杂质的析出，简化了提取纯化的流程，是一种良好的提取多糖的方法。

本研究采通过单因素实验选择对鱼腥草中多糖进行微波提取，以鱼腥草中的多糖提取率为指标，分别考察了对料液比、提取温度、提取时间和提取次数等因素对提取率的影响，通过正交设计法对微波法提取鱼腥草多糖的最佳条件进行了优化：料液比（m/V）为1∶20、提取温度为80℃、提取时间为40min、提取次数为2次。本研究优化的实验条件，对于今后开发利用鱼腥草多糖有重要的意义。

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