三氧化二砷对大肠癌LoVo细胞生长及Bcl-2、Bax表达的影响

张惠 陈卫昌

三氧化二砷对大肠癌LoVo细胞生长及Bcl-2、Bax表达的影响

张惠 陈卫昌

目的 研究三氧化二砷(As2O3)对人大肠癌细胞株LoVo中的生长及三氧化二砷对Bcl-2、Bax表达的影响。方法 采用不同浓度的As2O3处理LoVo细胞，MTT法测定细胞的生长抑制效应;免疫细胞化学法检测人结肠癌细胞LoVo中Bcl-2、Bax的表达。结果 MTT结果示As2O3对大肠癌LoVo细胞的生长有抑制作用，且有时间-剂量依赖性(P＜0.05或P＜0.01);免疫细胞化学法结果示As2O3可使LoVo细胞中Bcl-2表达下降，Bax表达升高(P＜0.01)。结论 三氧化二砷对大肠癌细胞生长有抑制作用，且呈时间、剂量依赖性;其机制可能与改变Bcl-2和Bax的表达水平有关。

As2O3;大肠癌;Bcl-2;Bax

三氧化二砷(Arsenic Trioxide，As2O3)是我国传统中药砒霜的主要成分，现已成为国内外研究热点。研究表明，三氧化二砷对多种实体瘤的增殖有抑制作用，亦可抑制人大肠癌细胞的生长，其机制可能是抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡［1-3］，但As2O3对大肠癌Bcl-2及Bax表达的影响的相关研究较少。本实验用As2O3作用于人大肠癌LoVo细胞株，观察肠癌细胞的生长及Bcl-2、Bax表达变化，旨在探讨三氧化二砷的抗肿瘤机制及防治肠癌的可行性。

1 材料与方法

1.1 细胞系 人大肠癌LoVo细胞系(中科院上海细胞生物学研究所)，在含10%胎牛血清的RPMI-1640(Gibco公司产品)完全培养液、37℃、含5%CO2、95%空气、95%湿度的培养箱中培养。

1.2 药物及试剂 三氧化二砷(1 g/L)(美国Sigma公司)，4℃冰箱保存，实验前用培养基稀释As2O3(终浓度分别为1.5μmol/L;3.0μmol/L;6.0μmol/L)。四甲基偶氮唑蓝(MTT)(美国Sigma公司)。Bcl-2、Bax免疫化学一抗、二抗(武汉博士德生物公司)。

1.3 实验分组 实验分为:对照组(未给药)，实验组1(As2O31.5μmol/L)，实验组2(As2O33.0μmol/L)，实验组3(As2O36.0μmol/L)

1.4 四氮唑蓝(MTT)比色还原法检测 按试剂盒说明书对各组进行实验，用酶标仪检测490nm波长处的每孔吸光度值(Absorbance，A 值)，计算细胞生存率(Survival Rate，SR)，以对照组的细胞生存率作为100%。细胞生存率(SR)=实验孔A值/对照孔A值×100%。

1.5 免疫细胞化学法检测 收集不同浓度处理48 h后的各组肠癌细胞，按SP法操作。Bcl-2、Bax蛋白表达结果判定:细胞胞浆或胞膜染为棕黄色为阳性。在高倍镜下随机选取10个视野，计数1000个细胞，以阳性细胞占总数的百分比作为阳性细胞百分率。

1.6 统计学方法 应用SPSS 12.0统计软件分析所有实验数据，组间比较用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 As2O3对大肠癌LoVo细胞生长的影响 MTT结果表明As2O3在1.5μmol/L浓度干预24 h后开始表现抑制作用，但作用尚不显著，随着浓度增加和作用时间延长，As2O3对肠癌细胞的抑制作用渐增强，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。见表1。

表1 As2 O3对肠癌细胞生存率的影响(%)

2.2 三氧化二砷对大肠癌细胞株中Bcl-2、Bax蛋白表达影响 大肠癌细胞对照组中的Bcl-2蛋白表达明显，阳性率为(87.50±5.10)%，经 As2O3作用后，实验组1(As2O31.5 μmol/L)Bcl-2蛋白阳性表达受到抑制，阳性率为(76.52±4.92)%，实验组2(As2O33.0μmol/L)Bcl-2蛋白表达减弱，阳性率为(55.95±2.24)%，实验组3(As2O36.0μmol/L)Bcl-2蛋白表达明显下降，阳性率为(35.95±3.24)%，有剂量依赖性，各组细胞Bcl-2蛋白的表达差异显著，且有统计学意义(P＜0.01)。Bax蛋白在对照组微弱表达，阳性率为(15.42±3.12)%，经As2O3作用后，随着浓度增加，各组表达增强，阳性率分别(26.73±3.72)%，(45.83±3.26)%，(73.68±2.15)%，有剂量依赖性，各组细胞Bax蛋白的表达差异显著，且有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

三氧化二砷是从砒霜中提炼出来的有效药用成分，其用于治疗白血病已取得较好的疗效，现将其应用于肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等多种实体瘤的实验和临床研究［1-3］亦渐增多，研究结果显示了良好的前景。研究表明，三氧化二砷主要是通过诱导细胞分化和凋亡抑制细胞生长而起抗肿瘤作用。刘琳等［4］通过台盼兰染色法和MTT法等观察体外活细胞生长，结果揭示As2O3可以明显抑制体外人大肠癌CoLo-320细胞的生长，并呈时效和量效特点;电子超微结构观察显示，As2O3可诱导人大肠癌细胞出现肿瘤细胞典型的凋亡形态学改变。

Bcl-2基因家族是目前最具代表性的调控细胞凋亡的基因家族，其家族主要成员包括两大类:一类是抑制细胞凋亡的基因，如bcl-2、bcl-xl、mcl-1等，bcl-2是其中最重要的基因，其表达上调，凋亡受抑制;另一类是促进细胞凋亡的基因，如bax、bad、bcl-xs等，Bax是一种与bcl-2相关的蛋白，与bcl-2有40%的同源性，其表达上调，能加速细胞凋亡［5］。研究表明，bcl-2与bax比例决定细胞凋亡程度［6］。

大肠癌的侵袭和转移过程比较复杂，其机制至今仍不甚清楚。本实验研究显示As2O3可下调大肠癌LoVo细胞Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，且呈时间-剂量依赖性，这为深入了解Bcl-2、Bax蛋白在大肠癌发生发展过程中的作用以及研究开发Bcl-2、Bax蛋白的分子靶向治疗药物提供了实验依据，值得临床进一步研究应用。

［1］Nakagawa Y，Akao Y，Morikawa H，et al.Arsenic trioxide-induced apoptosis through oxidative stress in cells of colon cancer cell lines.Life Sci，2002，29，70(19):2253-2269.

［2］Lin LM，Li BX，Xiao JB，etal.Synergistic effectof all-trans-retinoic acid and arsenic trioxide on growth inhibition and apoptosis in human hepatoma，breast cancer，and lung cancer cells in vitro.World JGastroenterol，2005，28，11(36):5633-5637.

［3］Chow SK，Chan JY，Fung KP.Suppression of cell proliferation and regulation of estrogen receptor alpha signaling pathway by arsenic trioxide on human breast cancer MCF-7 cells.JEndocrinol，2004，182(2):325-37.

［4］刘琳，邱少敏，赵伟，等.As2O3注射液体外对人大肠癌细胞抑制作用的观察.南京中医药大学学报，2004，20(1):42.

［5］Yang E，Zha J，Jockel J，et al.Bad，a heterodimeric partner for bcl-XL and bcl-2 displaces bax and promotes cell death.Cell，1995，80(2):285-291.

［6］Erdogan S，Ozer AY，BilgiliH.In vivo behaviour of vesicular urokinase.International Journal of Pharmaceutics，2005，295(1-2):1-6.

Effects of grow th and Bcl-2 and Bax expression by arsenic trioxide in hum an colorectal cancer LoVo c e l l s

ZHANGHui，CHENWei-chang.Department of Onclogy，Suzhou Municipal Hospital(North Area)，Suzhou2 1 5 0 0 8，，China

Objective To investigate the effects of arsenic trioxide on the cell growth and the expression of Bcl-2 and Bax in human colorectal cancer cells.M ethods In vitro，human colorectal cancer cells was treated by As2O3in various concentrations，and then MTTmethod was used to assay the effect of cell growth inhibition;the immunocytochemistry(ICC)analyzed the expression of Bcl-2 and Bax.Results As2O3inhibited the growth of the human colorectal carcinoma cells，and the inhibition effectwas time-dose dependent(P ＜0.05 or P ＜0.01).Bcl-2 expression was downregulated，and Bax expression was upregulated(P ＜0.01).Conclusion Arsenic trioxide had inhibition effect on the growth of human colorectal cancer cells in a time-dose dependentmanner，which may change the Bcl-2 and Bax expression and the level.

Arsenic trioxide;colorectal cancer;Bcl-2;Bax

215008 苏州市立医院北区肿瘤科(张惠);苏州大学附属第一医院消化内科(陈卫昌)