兔眼真菌性角膜炎模型的病理学观察

董贤慧 钱 涛 高维娟 贺小平 侯淑敏 韦素春 杨国兴

(承德医学院脊髓损伤与修复研究，河北 承德 067000)

兔眼真菌性角膜炎模型的病理学观察

董贤慧 钱 涛 高维娟 贺小平 侯淑敏 韦素春 杨国兴

(承德医学院脊髓损伤与修复研究，河北 承德 067000)

目的观察兔眼真菌性角膜炎(FK)动物模型的病理学改变。方法新西兰白兔15只(30只眼)，随机分为模型组、生理盐水组和正常对照组，每组10只兔眼。采用角膜基质注射法建立茄病镰刀菌性角膜炎模型，接种后2 d角膜刮片行真菌培养;接种后1、2、6、8、14、20 d和30 d，对兔眼溃疡评分;接种后3、8、15、30 d于裂隙灯下观察兔眼病理变化并拍照;接种后30 d处死家兔，取角膜，HE染色，光镜下观察组织病理学改变，PAS染色观察角膜基质层间的真菌菌丝，电镜观察角膜超微结构改变。结果模型组角膜刮片真菌培养均可见典型真菌菌落生长;与正常对照组相比，模型组在接种1、2、6、8、14、20 d和30 d后，角膜溃疡评分均有显著性差异(P＜0.05)。模型组接种3、8、15、30 d后，分别可见角膜溃疡、穿孔、前房积脓、新生血管、角膜白斑等并发症。HE染色、PAS染色、电镜观察均显示模型组角膜感染样改变。生理盐水组和正常对照组未见明显病理改变。结论角膜基质注射法可以成功建立兔眼的真菌性角膜炎模型，出现典型的形态学改变。

真菌性角膜炎;茄病镰刀菌;病理观察

由于真菌性角膜炎(FK)发病机制尚不清楚且缺乏有效药物，所以治疗棘手，预后差，可引起严重的角膜溃疡，常导致角膜穿孔、眼内炎，甚至角膜盲以及眼球丧失等，因此FK目前仍是眼科医师乃至全世界眼科领域所面临的一大难题。近年来FK发病率在我国明显升高〔1〕，已成为角膜盲的首要病因，因此，认识该病病理过程和特点，是对其进行有效治疗的前提和关键。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新西兰白兔15只，体重(1.6±0.5)kg，雌雄兼用，健康无眼疾，由河北省实验动物中心提供，合格证号:1005202。购进后进行2 w预饲养。饲养条件:(20～29)℃，相对湿度(40～60)%RH。

1.2 茄病镰刀菌菌液的制备 茄病镰刀菌(由中科院微生物研究所提供，编号为3.5840)。将茄病镰刀菌菌种(真空保存孢子粉)溶于生理盐水，转接在新鲜的PDA(Oxoid，产自Basing-stoke，Hampshire，UK)斜面上。为诱导茄病镰刀菌形成大量孢子而非菌丝，先将其35℃温箱孵育2 d，再25℃温箱孵育至7 d〔2〕，选择生长良好的菌落连续转接2次培养。取含有0.1%吐温80的无菌盐水1 m l，涂满整个菌落，用吸液管尖端轻轻地刺破菌落并与盐水混匀得到菌悬液，接着把含孢子和菌丝的混悬液移入无菌试管，待5 min重颗粒沉淀下来后把上层均一化的悬浮液转入另一无菌试管，盖紧盖子置于涡流器15 s使悬浮液充分混匀，梯度稀释，在显微镜下用血细胞计数板计数，调整浓度至1.5×106CFU/m l作为接种液浓度。

1.3 实验分组和模型制备 随机数字表法将30只兔眼分为3组:模型组，生理盐水组和正常对照组，每组10只兔眼。健康兔眼预防性应用妥布霉素滴眼液3d后，用速眠新1 m l/kg肌肉注射麻醉。接种眼用1/1 000的升汞和生理盐水冲洗2次，0.06%的碘伏消毒;铺巾;盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉2次。用开睑器开睑，固定上直肌，模型组用角膜基质注射针角膜基质层间注射10μl含标准茄病镰刀菌菌株的混悬液，生理盐水组注射10μl生理盐水，正常对照组不作任何处理。在接种的同时各组分别于结膜下注射10μl糖皮质激素。术后接种眼涂妥布霉素眼药膏。

1.4 动物模型建立成功的判断标准 ①形成典型的角膜溃疡灶;②3次角膜组织真菌培养中至少1次为阳性，有与接种菌同种菌落发育;满足以上两者即确定为接种成功。

1.5 检测指标 接种后2 d角膜刮片行真菌培养，KOH涂片检查及吉姆萨染色观察致病菌形态，以明确模型建立情况;接种后 1、2、6、8、14、20 d 和 30 d，按照溃疡评级评分标准(表 1)对实验兔眼的感染情况进行评分;接种后3、8、15、30 d于裂隙灯下观察其病理变化，30 d耳缘静脉空气栓塞处死家兔，取角膜，HE染色，光镜下观察组织病理学改变;PAS染色观察角膜基质层间的真菌菌丝;电镜观察角膜超微结构改变。

表1 溃疡评级评分标准

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0软件包进行统计分析。计量资料以±s表示，各组间不同检查时间点的临床评分比较采用重复测量资料的多因素方差分析。

2 结果

2.1 兔眼FK模型建立情况 模型组10只兔眼，全部发病，接种后2 d角膜刮片真菌培养可见典型茄病镰刀菌菌落，生长较快，呈棉花状，初期为白色最后可呈粉红色(图1)，刮片菌丝发现率为100%。吉姆萨染色可见:茄病镰刀菌菌丝成90°出芽生长(图1)，分生孢子有14个隔，其大分生孢子较粗壮，小分生孢子多呈假头状排列，产孢细胞较长。KOH涂片可见:成熟孢子的形状呈典型的镰刀形或新月形(图1)，为茄病镰刀菌感染，未发现细菌感染。按照动物模型建立成功的判断标准，确认模型建立成功。生理盐水组和正常对照组兔眼未见明显的角膜炎症表现，角膜刮片真菌培养未见菌落形成。

图1 兔眼FK角膜刮片

2.2 角膜接种后病理变化 生理盐水组和正常对照组兔眼在3、8、15、30 d 均可见角膜透明、虹膜结膜无充血肿胀(图 2a，2b，2c，2d)。模型组接种3 d可见角膜全层水肿，溃疡形成，干燥致密，粗糙不平，局部隆起有典型菌落生长(图2e)。接种8 d，溃疡面积进一步扩大，感染达到最高峰，角膜缘有新生血管长入(图2f)。接种15 d，溃疡面积不再扩大，显示出逐渐缩小的趋势，周围被大量新生血管包绕(图2g)。接种30 d，角膜白斑形成(图2h)，白斑周围无浸润，边界清楚，角膜周边有新生血管(图2i)。

图2 角膜接种后病理变化

2.3 角膜溃疡评分结果 模型组在接种后1 d、2 d、6 d、8 d、14 d、20 d、30 d角膜溃疡评分为别为:1.136 ±0.149，1.364 ±0.124，3.023 ±0.211，3.586 ±0.211，3.818 ±0.165，3.614 ±0.285，2.866±0.467。正常对照组和生理盐水组各个时间点角膜溃疡评分均为0分。与正常对照组相比，模型组在各个时间点角膜溃疡评分均有显著性差异(P＜0.05)，生理盐水组各个时间点评分均无改变(P＞0.05)。

2.4 HE染色观察角膜病理形态学变化 正常对照组和生理盐水组兔眼角膜HE染色可见:角膜基质细胞排列整齐，未见中性粒细胞浸润。模型组溃疡处角膜上皮浅基质层缺损，溃疡周边角膜上皮肿胀，角膜基质纤维排列紊乱，角膜基质层可见少量中性粒细胞，溃疡部位角膜上皮及浅基质修复，基质内较多成纤维细胞，细胞走形与基质纤维平行，基质内可见较多新生血管。见图3。

2.5 PAS染色观察结果 正常对照组和生理盐水组兔眼角膜PAS染色未见有菌丝。模型组PAS染色显示:真菌菌丝于角膜基质层内呈平行生长。见图4。

2.6 透射电镜观察家角膜超微结构改变 正常对照组和生理盐水组兔眼角膜透射电镜观察可见角膜细胞周围有大量的胶原原纤维，结构完整，排列整齐。模型组显示角膜前上皮增生，分层，大空泡形成。见图5。

图3 角膜病理学变化(HE)

图4 角膜PAS染色

图5 角膜透射电镜观察

3 讨论

在选择动物做模型时应该考虑动物的可用性及是否需要特殊种类的动物、适用性(包括饲养费，饲养难易程度等)以及动物的数量。FK发生于马、狗、爬行动物等均较少见。虽然目前有关于马的临床表现、愈合模式、危险因素及预后的报道〔3〕，但常见真菌研究中使用的动物多为小动物。小鼠和豚鼠能满足绝大多数真菌接种的需要，小鼠是真菌病动物模型中最常用的一种动物，但小鼠的角膜很小，进行手术操作时困难，感染后可取材的标本少，而且不利于真菌感染大体形态学的观察。本实验研究发现，新西兰白兔作为真菌性角膜炎模型的实验动物，角膜较大，且兔眼茄病镰刀菌性角膜炎有自愈趋势，其自然转归与人眼有一定差异。

选择临床常见的菌种，以便研究结果能应用于临床，为保证实验结果的可重复性和可靠性，尽可能选用权威微生物种保存机构保存的标准菌株，最佳者为分离自临床真菌性角膜炎患者的标本。目前所报道的与人类FK相关的致病菌有70余种〔4〕，常见的、主要致病菌属为镰刀菌属、曲霉菌属、青霉菌属、枝顶孢霉属、念珠菌属和暗色孢科真菌。我国是FK的高发区，外伤感染仍是目前最常见的原因，主要是丝状真菌感染，超过70%的分离菌株为茄病镰孢菌和烟曲霉菌。综合一些印度〔5〕、美国南部〔6〕和我国〔7，8〕的研究报道，镰刀菌是引起真菌性角膜炎最常见的真菌菌属，而镰刀菌属中最主要的致病菌种是茄病镰刀菌。茄病镰刀菌，也叫腐皮镰孢菌，是土壤中常见的腐生菌，是一种条件致病真菌，是最为常见的引起人类感染的镰刀菌，它属于镰刀菌属、半知菌亚门、丝孢菌纲、丝孢菌目、瘤座孢科，是广泛存在于土壤、植物、空气中的一种透明孢子丝菌〔9〕。因此，本实验选择茄病镰刀菌标准菌株作为接种菌。

目前常用的真菌性角膜炎动物模型制作方法包括角膜接触镜法、针刺法、感染角膜植片法、角膜划痕法、仿准分子激光角膜上皮磨镶术(LASEK)法〔10～12〕等。本研究选择兔眼角膜基质注射法作为探讨茄病镰刀菌性角膜炎的组织病理学特征的动物模型，有以下几个原因:①兔是最常用与观察真菌性角膜炎病理生理过程的动物模型，不受资源的限制;②基质注射法可相对准确地控制茄病镰刀菌孢子接种的量和角膜接种深度;③兔眼角膜溃疡容易观测，对抗真菌药物的治疗评价已经有一些比较成熟的指标可供借鉴。

FK的发生被公认为与真菌毒力因素和宿主免疫防御因素间相互作用的动态平衡被破坏有关。健康人结膜囊有真菌寄生，带菌率5%～83%不等。真菌寄生于健康人结膜囊而不致病，能与宿主维持共生现象，显示正常眼结膜及角膜对寄生真菌有足够的免疫力;事实上，健康人结膜囊内需氧菌、少量厌氧菌和某些真菌维持平衡生长，近年来眼科临床角膜真菌感染病例明显增多，被认为与抗生素及皮质类固醇激素广泛应用有关。眼部真菌感染很少是原发的，机体的状态和外在因素均不同程度的影响着感染的发生、发展。正常菌群与人体间的平衡一旦被打破，原来在正常情况下不致病的寄生真菌就可能成为致病性真菌而引起眼疾，同时并不排除外来真菌的侵入而引发角膜感染。而FK发病机理的研究至今没有确切的结论，也限制着临床FK防治研究的发展。

本研究在成功建立FK兔眼模型的基础上，进行了致病真菌菌丝及孢子的生长特点的观察，为临床上明确FK的致病菌种提供依据，从而进一步决定治疗方案。临床上早期明确诊断以及合理的治疗是提高该病患者生活质量的有效手段。目前用于明确FK的诊断方法有:角膜刮片、涂片检查、真菌培养、共焦显微镜检查、病理学检查、聚合酶链反应、基因芯片技术、荧光显微镜检测法和免疫学方法等。但能够应用于早期明确诊断的技术依然十分有限，各种检查方法都各有利弊。很多新技术尚处于研究阶段，其可靠性及稳定性仍需要进一步考证。临床上确诊FK依然依赖于实验室诊断，角膜刮片染色镜检依然是临床决策中的首选方法。目前还没有一种诊断技术能够完全达到临床诊断的需求。希望广大眼科工作者能在临床诊断FK方面有更多突破，以寻找一套确实可行又非常有效的明确临床角膜真菌感染的诊断方案。

致病真菌生长方式可以决定FK的治疗方案，茄病镰刀菌在兔角膜内呈平行生长，这种模式真菌侵犯角膜在垂直方向上感染程度轻，早期不易穿透至前房，但它会向水平方向扩散。所以此类角膜感染早期可以考虑药物治疗为主，选取敏感的抗真菌药物，局部联合全身应用，或及时选择板层移植手术而非穿透性角膜移植手术。本研究对兔眼FK模型进行了病理学观察，发现在兔角膜内，茄病镰刀菌菌丝呈平行生长，菌丝局限于浅层角膜板层结构间，因此，可为临床上针对茄病镰刀菌引起的FK选择最佳的治疗方法和手术时机提供重要的理论参考依据。实验还发现茄病镰刀菌性角膜炎早期表现为角膜浸润水肿，角膜基质中均匀分布炎性细胞，多数位于角膜前2/3，中性粒细胞为主，感染高峰时病灶也局限于角膜浅层，早期可见反应性的前房渗出，观察期间角膜感染情况发展缓慢，且随着病程延长感染灶有收缩局限的趋势，前房积脓消退。为清楚人类FK的病理过程，以及后期FK发病机制、诊断治疗的发展进行了补充，并为进一步研究高效、广谱、低毒的抗真菌药物奠定了基础。

1 Sun XG，Zhang Y，Li R，et al.Etiological analysis on ocular fungal infectionin the period of 1989-2000〔J〕.Chin Med J(Engl)，2004;117(4):598-600.

2 董贤慧，钱 涛，高维娟，等.茄病镰刀菌生物学特性及温度对其生长情况的影响〔J〕.中国真菌学杂志，2011;6(1):22-5.

3 Gaarder JE，Rebhun WC，Ball MA，et al.Clinical appearances，healing patterns，risk factors，and outcomes of horses with fungal keratitis:53 cases(1978-1996)〔J〕.JAm Vet Med Assoc，1998;213(1):105-12.

4 Tanure MA，Cohen EJ，Sudesh S，et al.Spectrum of fungal keratitis at Wills Eye Hospital，Philadelphia，Pennsylvania〔J〕.Cornea，2000;19(3):307-12.

5 Chowdhary A，Singh K.Spectrum of fungal keratitis in north India〔J〕.Cornea，2005;24(1):8-15.

6 Liesegang TJ，Forster RK.Spectrum ofmicrobial keratitis in South Florida〔J〕.Am JOphthalmol，1980;90(1):38-47.

7 Xie L，Zhong W，ShiW，et al.Spectrum of fungal keratitis in North China〔J〕.Ophthalmology，2006;113(11):1943-8.

8 Qiu WY，Yao YF，Zhu YF，et al.Fungal spectrum indentified by a new slide culture and in vitro drug susceptibility using Etest in fungal keratitis〔J〕.Curr Eye Ras，2005;30:1113-20.

9 Mayayo E，Pujol I，Guarro J.Experimental pathogenicity of four opportunist Fusarium species in a murine model〔J〕.JMed Microbiol，1999;48(4):363-6.

10 Wu TG，Wilhelmus KR，Mitchell BM.Experimental keratomycosis in a mousemodel〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003;44(1):210-6.

11 杜 蕊，吴 洁，马吉献，等.兔曲霉菌性角膜炎动物模型建立及角膜共焦显微镜检查〔J〕.第四军医大学学报，2006;27(21):1925-8.

12 梁 涛，赵桂秋，刘蓬蓬，等.仿LASEK法建立烟曲霉菌角膜炎动物模型的研究〔J〕.眼科研究，2008;26(9):641-4.

Establishment and pathological observation of rabbitmodel w ith fungal keratitis

DONG Xian-Hui，QIAN Tao，GAO W ei-Juan，et al.
Department of Pathophysiology，Chengde M edical College，Chengde 067000，Hebei，China

ObjectiveTo observe the histopathological changes of animalmodelswith fungal keratitis.Methods15 New Zealand white rabbits(30 eyes)were divided into 3 groups，fungal keratitismodel，saline and control groups.Fusarium Solaniwas injected into the corneal stroma of the eyes to establish fungal keratitis.Saline was injected into the corneal stroma of the eyes of saline group.Noting was done in the control group.Lesion of cornea was taken and cultured after inoculated fungus for 2 days.The eyes of each group were examined clinically and respectively by slit lamp with a scoring system on day 1，2，6，8，14，20 and day 30.Photograph through the slit lamp on day 3，8，15 and day 30 after the inoculation.The rabbitswere sacrificed with ear vein of air embolism at30 day to observe the histological changes through HE，PASand electronmicroscope.ResultsAfter inoculating fungus for2 days，pathological staining showed that scattered fungal spores and hyphae were at corneal epithelium，and hyphae grew into corneal stroma.After inoculating fungus for3，8，15 and 30 days，there were corneal edema，ulceration，dryness and tightness，rough，uneven and swelling.HE，PAS stain and electron microscope showed that therewas corneal inflammation inmodel group.Therewas no obvious pathologic change in saline and control groups.ConclusionsFusarium Solani injection into the corneal of the eyes can be used to establish animalmodelswith fungal keratitis successfully with typical histopathological changes.

Fungal keratitis;Fusarium Solani;Pathological observation

R772.21;R363.2+1

A

1005-9202(2012)12-2527-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.040

国家科技支撑计划重大项目(No.2007BAI26B07)

高维娟(1966-)，女，教授，博士，主要从事纳他霉素治疗真菌性角膜炎药理学研究。

董贤慧(1983-)，女，助教，硕士，主要从事纳他霉素治疗真菌性角膜炎药理学研究。

〔2011-10-18收稿 2011-12-12修回〕

(编辑 曹梦园)