实验动物运输盒微生物指标检测分析

张华琼，赵 田，范方玲，罗素兰，夏 爽，黄 麟，吴燕茹

（成都生物制品研究所，四川成都 610023）

因乙型脑炎活疫苗扩大生产，对实验动物的需求日益增大，我们新建了隔离器车间和207车间，并将204车间的SPF金黄地鼠全部转移到隔离器车间，隔离器车间主要是保种育种，为207车间提供种子；207车间主要是SPF金黄地鼠饲养繁殖，为乙脑疫苗生产提供10～14日龄仔鼠。另外，204车间主要生产SPF小鼠和清洁级豚鼠，供各种产品动物试验用；而205车间则是各种动物试验的场所。

在动物从204车间转移到隔离器车间的过程中，独立通气笼盒 （individually ventilated cages，IVC）是否能确保动物未受到污染?在动物从207车间供应到乙脑生产车间以及从204车间供应到205车间的过程中，各种动物运输盒又是否能确保动物未受到污染?带着这样的问题，我们开展了实验动物运输盒微生物指标验证工作［1］。

运输盒是SPF动物（或清洁动物）在不同车间之间转运的笼具，运输盒应具有一定的通透性，以保证其中的动物能正常呼吸，避免“出汗”或闷死；同时运输盒经过有效的高压灭菌后，在运输过程中应保持良好的密闭性，微生物指标应达到预期的要求，防止外界脏空气污染盒内动物［2］。

本试验选用了不同规格的笼盒来做检测和比较，其中，小IVC笼盒主要用于金黄地鼠从204车间到隔离器车间的转移；大IVC笼盒和普通运输盒主要用于小鼠、豚鼠从204车间到205车间的运输；以及金黄地鼠仔鼠从207车间到乙脑活疫苗生产车间的运输。

连续3次测试，结果显示大、小IVC笼盒在整个实验动物的转运过程中微生物水平能始终保持在洁净度C级标准内，为控制实验动物运输盒质量提供了一定的参考依据。

1 材料和方法

1.1 运输盒

小IVC笼盒15个，规格（325×210×185）mm，盖子顶部有一直径60 mm的生命窗（带滤膜），外观完好，放入一个大的不锈钢箱子中，箱子加盖；大IVC笼盒3个，规格（500×360×280）mm，盖子顶部有一直径86 mm的生命窗（带滤膜），外观完好；甲普通运输盒3个，规格（466×314×200）mm，不锈钢盖子上有2张矩形滤膜，（229×111）mm，外观完好；乙普通运输盒3个，规格（600×400×210）mm，塑料盖子上有1张矩形滤膜，（402×203）mm，盒子两侧各有2张矩形滤膜，（188×66）mm，外观完好；滤膜均为单层，材质为无纺布，可清洗、耐高压。

1.2 沉降皿

胰蛋白胨大豆琼脂培养基（tryptic soy agar，TSA）平皿，直径90 mm，由本所培养基室提供。

1.3 方法

TSA平皿和高压灭菌后的运输盒按程序传入204车间动物饲养间内。在饲养间内逐一打开运输盒，放入已标记TSA平皿（小IVC笼盒1付/盒；大IVC笼盒2付/盒；普通运输盒2付/盒），打开平皿盖，盖好运输盒盖子。将运输盒传出饲养间，在204车间动物待发处放置0.5 h。小 IVC笼盒的转移：按照《SPF金黄地鼠转移方案》，将小 IVC笼盒从204车间经车间外周道路运送到207车间电梯口；经电梯进入二楼隔离器车间，通过走廊，经清洗间传递窗进入隔离器室；在隔离器室，逐一将小 IVC笼盒传入隔离器内，在隔离器内打开笼盒，盖上沉降皿盖，取出沉降皿。大IVC笼盒和普通运输盒的转移：将大IVC笼盒和普通运输盒从204车间经车间外周道路运送到205车间（中途绕行往返3次，相当于到达病毒性疫苗一室的时间），在超净工作台上打开笼盖，取出沉降皿。将培养皿送微生物实验室培养，于（20～25）℃下倒置孵放3 d，计数菌落；再于（30～35）℃下倒置孵放2 d，计数菌落。培养皿沉降菌应小于50 cfu/4h的标准规定［3］。

2 结果

2.1 采样时间

平皿从放入笼盒打开盖子，到从笼盒中取出，每次时间均在1 h以上，按1 h计算；

2.2 小IVC笼盒检测结果

连续3次对小IVC笼盒进行检测，结果见表1。第1次试验，各个笼盒都有不同程度长菌，1～6个/皿不等；第2、3次试验效果较好，除一个平皿见10个菌落外，其余都为0～2个/皿；且每次检测平均结果都小于50 cfu/4 h。

2.3 大IVC笼盒检测结果

连续3次对大IVC笼盒进行检测，结果见表2。试验中各个笼盒都有不同程度长菌，0～6个/皿不等；且每次检测平均结果都小于50 cfu/4 h。

2.4 普通运输盒检测结果

第1次为甲普通运输盒，培养结果可见较多霉菌，多数在10个/皿以上，虽然细菌菌落数不多，都在5个/皿以下，但各种菌落总数平均结果都远远大于50 cfu/4 h。第2次改为乙普通运输盒，检测结果与第1次一致，说明普通运输盒隔离保护效果不理想，故不再做第3次试验。详见表3。

2.5 空白对照

每次试验都附带3个平皿作空白对照，培养结果均未见任何菌落，表明TSA培养基本身是没有被污染的。详见表4。

2.6 菌落形态

IVC笼盒试验结果均为细菌菌落，其中90％细菌的菌落为乳白色，突起，湿润，光滑，圆形，不透明，直径1.5～3.0 mm；10％细菌为浅黄色，突起，湿润，光滑，圆形，不透明，直径0.5～1.5 mm。

普通运输盒试验结果多见霉菌，其中80％霉菌为灰蓝色，较小霉菌点，表面呈粉末状；20％霉菌为大量绒毛状菌丝，黄色粉末，充满整个平皿。

表1 小IVC笼盒3次检测结果Tab.1 Microbial test results of settling plates in small IVC cages

表2 大IVC笼盒3次检测结果Tab.2 Microbial test results of settlingplates in large IVC cages

3 讨论

在国内，动物运输盒材料主要有纸质和塑料两种，运输盒上附带的滤膜也多是单层多孔无仿布；膜面积越小，盒内污染的机会越小。本试验仅选择了塑料运输盒，供大家参考。

表3 普通运输盒2次检测结果Tab.3 Microbial test results of settling plates in conventional trasport cages

表4 空白对照3次检测结果Tab.4 Microbial test results of settling plates in blank controls

甲普通运输盒带不锈钢盖，盖子上方矩形面积内密布条形孔，夹一层滤膜；乙普通运输盒带塑料盖，盖子上方和盒子两侧打孔，密布直径2～3 mm圆孔，覆盖一层滤膜。较大面积的滤膜让其通透性倍增，微生物侵入的几率也同时增加，以至沉降菌检测结果大大超标，而且有许多霉菌，不能达到洁净度C级标准的微生物要求。

大小IVC笼盒盖上盖子后，只有生命窗通过滤膜与外界相通，密闭性很好，只有在开盖装动物时盒子内部才全部暴露在饲养间环境中，所以沉降菌检测结果较少，而且大都是细菌，菌落形态与饲养间环境内的沉降菌基本一致，符合C级标准的微生物要求；所以，与普通运输盒相比较，IVC笼盒作为运输盒更理想。

试验中小IVC笼盒又被装入大不锈钢箱中，所以沉降菌检测结果比大IVC笼盒还少；因此可以证明SPF金黄地鼠在从204车间转运到隔离器车间时未受到污染。

试验检测结果中第1次普遍高于第2，3次，这可能与开盖放平皿的熟练程度有关，第1次放入操作较慢，饲养间空气落下菌要多些，后来动作快了，落下菌就少了。

另外，试验中分离的细菌霉菌未进一步鉴定。是否有SPF动物要求排除的细菌；是否与饲养间环境菌、与外界空气中微生物的种类相一致，需要进一步鉴定、比较和分析。