大型实验动物屏障设施环境微生物和尘埃粒子的动态监控

王 晶，刘 伟，袁水娟，谈小倩，谢 恩，徐 平，芮 荣

（1.南京农业大学动物医学院，南京 210095；2.中国科学院上海实验动物中心，3.上海斯莱克实验动物有限责任公司，上海 201615）

大型实验动物屏障系统环境的稳定是保障实验动物规模化生产、供应和动物质量的基本条件。屏障系统内的环境微生物控制与其生产种群的来源、空气洁净度、物品的消毒或灭菌以及人员的进出和操作等有关。在现行的实验动物设施与环境国家标准(GB14925—2001)中，只规定了静态状况下屏障系统应该达到的基本条件或标准［1］，而对动态运行中的屏障系统没有作出明确的规定。在生产型屏障系统中，屏障内落下菌与尘埃粒子的变化会因动物饲养种类，密度，饲养工作的不同而呈现不同的变化规律。本实验选择两个饲养不同品种动物的屏障系统，在不同时间段对屏障系统进行空气落下菌与尘埃粒子的测定，研究生产型屏障系统动态环境下微生物和尘埃粒子的变化规律，并分析生产活动对环境指标的影响，为实验动物屏障系统动态环境的质量标准制定提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验仪器与试剂

直径9 cm的塑料培养皿，超净工作台，显微镜，生化培养箱，高压蒸汽灭菌锅，电子天平，恒温水浴锅，FLUKE983激光粒子计数器，不锈钢传递罐，冰箱，无菌工作衣及无菌手套等。营养肉汤培养基(上海康润生物科技有限公司);琼脂粉(上海盛思生化科技有限公司)。

1.2 试验场所环境及饲育方式

1.2.1 屏障系统等级及环境：清洁级屏障系统［Ⅰ］：小鼠饲养屏障，全部饲养小鼠，测定地点选择该屏障小鼠饲养室及洁净走廊和污物走廊。清洁级屏障系统［Ⅱ］：大鼠和兔饲养屏障，其中有兔饲育室，和大鼠饲育室，分别测定兔饲育室和大鼠饲育室。

屏障系统［Ⅰ］和［Ⅱ］，单个饲育室容积172 m3，房间顶部进风口6个，四角回风口4个。屏障设施保持环境条件为：温度(22±2)℃，湿度(50± 10)%，照明为昼夜交替各12 h。通风换气次数为15次/h左右。

1.2.2 饲育方式：饲养生产工作时间为7∶00～15∶00，实验期间喷雾消毒［2］时间为13∶00。大小鼠采用塑料笼具饲养，颗粒饲料饲喂，单独水瓶饮水，每日更换部分笼具。添加饲料及更换水瓶。小鼠笼底板面积0.042 m2，笼内高度0.13 m，室内采用饲育架多层放置，小鼠房间放置小鼠笼1 728个，小鼠饲育密度10笼/m3，大鼠笼底板面积0.09 m2笼内高度0.18 m，大鼠房间放置大鼠笼600个，饲育密度约为3.5笼/m3，兔采用双层铁笼饲养，底板面积0.45 m2，笼内高度0.42 m，兔房放置兔笼288个，饲育密度约为1.67笼/m3。

1.3 落下菌与尘埃粒子的采集

普通琼脂培养皿和激光粒子计数器于超净台紫外线照射20 min后，用无菌密封袋密封，用酒精喷雾消毒后从传递窗传入。采样人员经过沐浴后穿着无菌隔离衣，无菌隔离脚套，戴无菌口罩和无菌手套后进入。

培养皿放置位置：动物房一条对角线上取3点，正中一处，两边距墙1 m各放一个，清洁走廊，污染走廊等间距放置3个。放置方法：放置于地面，平板盖打开，扣放于平板旁，计时30 min。尘埃粒子采样方法：使用激光粒子计数器测定粒子浓度直径≥0.3μm粒子浓度，采样器放置高度1 m，采集空气体积设定1 L。

放置时间：00∶00，06∶00，11∶00，16∶00，样品重复采集3次。

1.4 样品处理

1.4.1 动物房落下菌数量分析：采集好的培养皿放入37℃生化培养箱，培养24～48 h，取出于超净台中计录菌落数，属于相同房间的培养皿加权取平均值为平均菌落数。采用SPSS分析软件［3］分析统计结果。

1.4.2 空气尘埃粒子数统计：从激光粒子计数器读取空气中直径≥0.3μm尘埃粒子数量，采用 S PSS分析软件分析统计结果。

2 结果

2.1 落下菌落数量分析

屏障系统1内清洁走廊、污物走廊工作日落下菌数量在11∶00时均显著高于其余时间(P＜0.05)，在其它三个时间差异不显著(P＞0.05)。小鼠饲育室工作日落下菌数量在11∶00时显著高于06∶00时和16∶00时(P＜0.05)，与00∶00时差异不显著(P＞0.05)，小鼠饲育室工作日落下菌数量在00∶00时、06∶00时和16∶00时三个时间差异都不显著（P＞0.05）。

屏障系统1内清洁走廊、污物走廊休息日落下菌数量在各时间段差异均不显著（P＞0.05）。小鼠饲育室在休息日落下菌数量各时间点差异均不显著（P＞0.05）。（表1）。

屏障系统2兔饲育室工作日落下菌数量在11∶00时均显著高于其余时间（P＜0.05），在其它三个时间差异不显著（P＞0.05）。大鼠饲育室工作日落下菌数量在11∶00时显著高于06∶00时和16∶00时（P＜0.05），在16∶00时显著低于00∶00时和06∶00时（P＜0.05），00∶00时与06∶00之间差异不显著（P＞0.05）。

2.2 直径≥0.3μm尘埃粒子数量分析

屏障系统2兔饲育室休息日落下菌数量在各时间段差异均不显著（P＞0.05）。大鼠饲育室休息日落下菌数量在各时间段差异均不显著（P＞0.05）。（表2）。

屏障系统1内清洁走廊、污物走廊工作日尘埃粒子数在11∶00时均显著高于其余时间（P＜0.05），在其它三个时间差异不显著（P＞0.05）。小鼠饲育室工作日尘埃粒子数在11∶00时显著高于其余时间（P＜0.05），在00∶00时显著高于06∶00时和16∶00时（P＜0.05）。

屏障系统1内清洁走廊、污物走廊休息日尘埃粒子数在各时间段差异均不显著（P＞0.05）。小鼠饲育室休息日尘埃粒子数在00∶00时显著高于其余时间（P＜0.05），在06∶00时显著高于11∶00时（P＜0.05），11∶00时和16∶00时差异不显著（P＞0.05）（表3）。

屏障系统2兔饲育室工作日尘埃粒子数在11∶00时均显著高于其余时间（P＜0.05），在16∶00时显著高于00∶00时（P＜0.05），00∶00时与06∶00时差异不显著（P＞0.05）。大鼠饲育室工作日尘埃粒子数在16∶00时显著低于其余时间（P＜0.05），在其它三个时间差异不显著（P＞0.05）。

屏障系统2大鼠饲育室休息日尘埃粒子数在各时间段差异均不显著（P＞0.05）兔饲育室休息日尘埃粒子数在11∶00时均显著高于其余时间（P＜0.05），在16∶00时显著高于00∶00和06∶00时（P＜0.05），00∶00时与06∶00时差异不显著（P＞0.05）。（表4）。

表1 屏障系统1内小鼠饲育室和洁净与污物走廊落下菌的检测结果字典Tab.1 Detection of airfall bacteria in the mice room and corridor of barrier systemⅠ

表2 屏障系统2内大鼠饲育室与兔饲育室落下菌的检测结果字典Tab.2 Detection of airfall bacteria in the rat room and rabbit room of barrier systemⅡ

表3 屏障系统1内小鼠饲育室和洁净与污物走廊尘埃粒子的检测结果Tab.3 Detection of dust in the m ice room and corridor of barrier systemⅠ

表4 屏障系统2内大鼠饲育室与兔饲育室字典尘埃粒子的检测结果Tab.4 Detection of dust in the rat room and rabbitroom of barrier systemⅡ

3 讨论

在符合国家标准的静态实验动物屏障系统引入实验动物繁育群后，屏障系统内各项环境和空气微生物指标均会发生明显的变化。洁净走廊，污物走廊和动物饲育室内落下菌和尘埃粒子数量均会升高，但由于动物生产的周期性和动物生活习性的相对固定，落下菌和尘埃粒子又随着昼夜和不同生产时间产生规律性的变化。

屏障系统［Ⅰ］内洁净走廊、污物走廊和小鼠饲育室和屏障系统［Ⅱ］内大鼠饲育室和兔饲育室内在工作日落下菌数量11∶00时均显著高于06∶00时和16∶00时，表明饲养活动可使屏障内落下菌与尘埃粒子数明显升高，人的饲养管理操作，如更换笼器具、配种、离乳、添加饲料等工作，可以增加落下菌与尘埃粒子的数量，这与实验型屏障系统变化规律不同，实验型屏障生产系统工作量较小，落下菌数量相对较低［4］。而洁净走廊、污物走廊、小鼠饲育室、大鼠饲育室和兔饲育室内落下菌数量在16∶00时明显降低，表明饲养结束后喷雾消毒可使屏障内落下菌与尘埃粒子数明显下降，喷雾形成的大量液滴在空气中会黏附大量尘埃粒子，由于重力作用很快降落到地面上，减少了空气中落下菌与尘埃粒子的数量。大小鼠饲育室在00∶00时落下菌和尘埃粒子数量较高，表明屏障内大、小鼠夜间活动较多，这与大、小鼠属于夜行性动物的行为特症有关。屏障系统［Ⅰ］内污物走廊内落下菌与尘埃粒子数始终高于洁净走廊，主要原因是洁净走廊由于其空气压力梯度最高，排风能力强，细菌和尘埃含量始终保持在一个较低的水平。污物走廊在工作日则由于开门、门缝及压差等缘故，使饲育室内的细菌与尘埃粒子进入，造成污物走廊细菌和尘埃粒子数量升高。

屏障系统［Ⅱ］中大鼠饲育室内的空气落下菌和尘埃粒子数量都远远高于兔饲育室和屏障系统1中小鼠饲育室。其原因在于：大、小鼠均为塑料饲育笼内铺设木屑垫料笼养，但大鼠的体型和活动量均大于小鼠，且饲料、饮水和排泄物都多于小鼠，大鼠的活动可以使时饲养笼中的细菌和尘埃更多的漂浮在空气中。

在屏障系统［Ⅰ］和［Ⅱ］中，污物走廊、小鼠饲育室、兔和大鼠饲育室内落下菌和尘埃粒子数量均高于国家标准GB14925—2001对静态实验动物环境设施的要求，

其中大鼠饲育室都在100个/皿以上，而小鼠和兔饲育室在100个/皿以下，其中小鼠饲养室与张华琼等报道的结果动物饲养间空气落下菌数可控制在100个/皿以下一致［5］。而洁净走廊除工作日11∶00外，落下菌数量均在3个/皿以下。可见，动态屏障系统内各功能区域落下菌与尘埃粒子数量与区域功能，工作状态和动物品种有关。因此，在实际生产和环境监测中中，应根据饲养的动物种类、密度和饲养方式和不同功能区域来分别制定相应的落下菌和尘埃粒子监控指标。

空气中的尘埃粒子的数量多少可以直接反映空气的洁净程度，在屏障系统中，空气经过预初效，初效，中效，高效四级过滤后进入，对于直径≥0.3 μm的尘埃，可达到99.97％的过滤效果［6，7］。屏障中尘埃粒子主要来源为动物和人的活动，通过对空气中尘埃粒子的监测，可以间接反映动物与人的活动情况，而空气中的微生物一般附着在尘埃粒子上，尘埃粒子浓度的变化可以间接反映饲育室内空气细菌量的变化。尘埃粒子对动物和人的影响大部分是通过呼吸道引起的，少量是通过皮肤、眼及粘膜。直径小于2.5μm的尘埃粒子可以直接进入肺部导致疾病发生。空气中悬浮的尘埃粒子数量分布又呈现一定的规律，在动态屏障系统空气中直径≥0.3μmm的尘埃粒子数最多，且变化较明显，故本研究选择直接≥0.3μm尘埃粒子作为空气洁净度指标来评价屏障系统空气洁净变化程度。

屏障系统［Ⅰ］和［Ⅱ］中各功能区域直径≤0.3 μm尘埃粒子数量都显著高于静态屏障，且不同功能区域与不同饲养室之间尘埃粒子浓度不同。

本实验通过对生产型实验动物屏障设施内的空气落下菌与尘埃粒子进行实时监控，发现屏障系统各功能区域空气落下菌与尘埃粒子变化有一定规律性，且变化在一定范围内，在实际生产中，如果细菌数量或者尘埃粒子远远高于平均值，则有可能发生了管理上的问题、动物微生物控制质量下降或者设备运转出现故障等，这对于评价实验动物屏障设施的动态运行，制定屏障设施动态环境控制参数以及屏障设施的维护，实验动物微生物质量的监控都有积极的参考意义。

［1］国家质量技术监督局.GB14925—2001，实验动物环境及设施［S］.2001.26-28.

［2］宗阿南，董婉维，张艳华，等.动物实验室房间消毒方法的研究［J］.中国比较医学杂志，2003，13（6）：381-384.

［3］翟青新，沈黎，瞿叶清，等.实验动物设施静态与动态空气落下菌数检测结果分析［J］.实验动物科学，2008，25（3）：39 -41.

［4］柯贤福，周莎桑，楼琦，等.实验动物屏障系统微生物动态状况［J］.中国比较医学杂志，2010，20（3）：47-50.

［5］张华琼，黄麟，夏爽，等.动物繁育设施空气落下菌数观察与分析［J］.实验动物与比较医学，2007，27（3）：195-197.

［6］徐平.实验动物管理与使用操作技术手册［M］.上海：上海科学技术出版社，2007：335-336.

［7］宗阿南，史晓萍，福山侑荣，等.屏障系统动物室单向流与乱流空气净化方式的细菌比较分析［J］.中国比较医学杂志，2007，17（8）：476-477.