28醇对MPTP致帕金森病模型小鼠行为学的作用及其机制①

王涛，刘雁勇，杨楠，纪超，陈彪，左萍萍

28醇对MPTP致帕金森病模型小鼠行为学的作用及其机制①

王涛1，刘雁勇2，杨楠2，纪超2，陈彪1，左萍萍2

目的 观察28醇对帕金森病模型小鼠行为学改善作用，并探讨其可能的机制。方法75只成年雄性C57小鼠随机分为5组：对照组，模型组，28醇低剂量组(25 mg/kg)、中剂量组(50 mg/kg)、高剂量组(100 mg/kg)，每组15只。除对照组外，其他各组间隔2 h腹腔注射MPTP 16 mg/kg共4次造模。28醇各剂量组按剂量连续灌胃给药2周，其他组给予等量0.5%缩甲基纤维素钠(CMC)无菌水。行为学检测采用转杆试验和自发运动试验，Nissl染色组化实验检测纹状体神经元数量及状态，Western blot实验检测黑质区p-Erk1/2、p-p38 MAPK、p-JNK表达。结果与对照组相比，28醇高剂量组转杆试验和自发运动试验成绩改善(P<0.05)。28醇中剂量和高剂量组含有Nissl小体的神经元显著增多并染色加深(P<0.05)，黑质区p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达与模型组相比下降(P<0.05)，p-Erk1/2表达与模型组无显著性差异。结论28醇可改善帕金森病小鼠行为学指标。可能通过调节MAPKs家族信号转导因子p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达，减少黑质纹状体通路的损伤发挥其作用。

帕金森病；神经保护；行为学；丝裂原活化蛋白激酶；28醇

帕金森病是常见的与衰老有关的神经退行性疾病，其主要特征为黑质纹状体通路多巴胺能神经元发生变性坏死。目前临床治疗和开发中的抗帕金森病新药主要包括以下7类[1]：多巴胺替代类药、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B抑制剂、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)抑制剂、中枢性抗胆碱药、谷氨酸受体拮抗剂(NMDA受体拮抗剂)、其他(腺苷A2a受体拮抗剂、α2肾上腺素能受体拮抗剂及神经保护类药物)。目前还没有可靠的药物能确切阻断帕金森病的病程，大部分化学药物长期使用效果不佳，且多具有较强毒副作用。28醇是一种从米糠蜡、甘蔗蜡等提取的天然长链高级脂肪醇，可有效降低血清胆固醇水平，抗脂质过氧化，抑制血小板凝聚，抑制血管内皮平滑肌细胞的增生等[2]。前期工作发现，28醇可以改善6-羟多巴胺致帕金森病模型大鼠的行为学指标，并具有神经保护作用[3-4]。本研究拟在MPTP致帕金森病小鼠模型上进一步验证28醇的行为学改善作用并探索丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族中的Erk1/2、p38 MAPK、JNK活化形式(磷酸化)是否参与其神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康C57BL/6小鼠75只，雄性，由北京维通利化动物公司提供；体重20~25 g，行为测试无异常。随机分为对照组(Sham control)、模型组(Model)、28醇低剂量组(Ocs-L,25 mg/kg·d)、28醇中剂量组(Ocs-M,50 mg/kg·d)、28醇高剂量组(Ocs-H,100 mg/kg·d)，每组15只。

1.2 主要试剂和药品 28醇单体由中国医学科学院药物所朱海波教授惠赠，以含0.5%缩甲基纤维素钠(CMC)无菌水助溶制成悬浮液；兔多克隆抗体p-p38 MAPK抗体、p-Erk1/2抗体和p-JNK抗体：美国CELL SIGNALING公司；兔多抗β-actin抗体：美国SANTA CRUZ公司；HRP标记羊抗兔二抗及SP-9002免疫组化试剂盒：北京中杉金桥公司；MPTP：美国SIGMA公司；转杆实验仪：北京吉日欧科技开发公司；自发运动监测仪：中国医学科学院药物研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 模型小鼠的制备[5]除对照组外，其他各组小鼠腹腔注射MPTP 16 mg/kg(0.5 ml/100 g)，共4次，每次间隔2 h。对照组注射等量生理盐水。于造模后第2天，28醇治疗组小鼠以25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg(0.1 ml/10 g)每天灌胃给药1次，对照组和模型组给等量CMC无菌水，连续给药2周。2周后开始行为学检测。

1.3.2 行为学检测

1.3.2.1 转杆实验 水平金属杆(直径3 cm)长约为50 cm，用金属板分隔为5段，用挡板隔开动物彼此不受影响，转速16 r/min。小鼠在转杆上开始爬行后仪器自动记时，从转杆跌落下来时可以被红外装置所监测，自动停止记时并显示小鼠在转杆上运动的时间。如小鼠转杆时间不足5 min，记录实际时间；如超过5 min，记为5 min。初次学习5次后测定。

1.3.2.2 自发运动实验 将小鼠置于自发运动监测仪(圆形，直径50 cm)中央部，保持环境安静。自发运动监测仪内有多束红外线穿过，动物活动时阻隔红外线束，即可被检测并记数。预适应2 min后，记录小鼠5 min内自发运动次数，包括直立运动和水平运动次数的总和。

1.3.3 纹状体Nissl染色 行为学检测后，每组取3只小鼠经戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，剪开胸腔，暴露心脏，从左心尖处插入灌流针，剪开右心耳。先用PBS进行灌流，待血液冲洗干净后改用4%多聚甲醛继续灌流约15 min，断头取脑置4%多聚甲醛中4℃过夜。然后转入15%、20%和30%蔗糖溶液中梯度脱水，4℃存放。冰冻切片机切取冠状脑片，片厚12 μm，直接贴于多聚赖氨酸包被的玻璃片上，-20℃保存，用于组织化学检测。选取纹状体结构完整的切片，室温下自然晾干，浸入氯仿中室温30 min，浸入预冷的丙酮中10 min，室温自然晾干。PBS稍洗，切片浸入0.1%焦油紫液室温10 min，流水冲洗3 min，95%乙醇室温下分色，镜下观察控制分色时间至满意，依次脱水透明，中性树胶封片。每只动物取对应部位2张脑片进行光密度值统计，分析软件为Image-Pro Plus。1.3.4黑质区MAPKs通路蛋白表达的检测 行为学检测后，每组取6只小鼠1%戊巴比妥钠麻醉，迅速断头取脑，在冰面上迅速分离出两侧黑质，-80℃冰箱保存。黑质组织放在平皿中并加入适量新鲜配制的RIPA裂解液，剪刀剪碎组织块(冰上操作)；4℃ 3000 g离心5 min；弃上清，预冷PBS洗涤组织沉淀，至液体无红色，以避免血红蛋白的影响；将组织沉淀转移至玻璃匀浆器，每30 mg组织加RIPA裂解液300 μl，冰上反复匀浆30~60 min；4℃ 14000 g离心15 min，取上清。用Bradford法定量蛋白。Western blot电泳法[6]检验。所有Western印迹实验至少重复3次，电泳条带结果分析采用AlphaEase®FC软件，定量分析时相对密度采用磷酸化蛋白/总蛋白比值表示。

1.4 统计学处理 数据采用(xˉ±s)表示，以SPSS 11.5统计软件进行单因素(one-way ANOVA)方差分析，组间比较采用多个样本均数比较的方差分析及Tukey's HSD事后检验，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 行为学 模型组5 min内的自发运动次数明显低于对照组(P<0.01)，给药2周后，28醇低剂量组和中剂量组5 min内的自发运动次数与模型组无显著性差异；而28醇高剂量组与模型组相比，自发活动次数增加(P<0.05)。模型组转杆停留时间明显低于对照组(P<0.01)；给药2周后，28醇各剂量组转杆停留时间均高于模型组(P<0.05)。见表1。

2.2 纹状体Nissl染色 与对照组相比，模型组纹状体区多数神经元尼氏小体蓝色颗粒减少，胞浆空泡样变性，光密度值明显降低(P=0.0022)；28醇中剂量和高剂量组小鼠纹状体区与模型组相比，含有Nissl小体的神经细胞数量显著增多并染色加深，光密度值升高(P<0.05)。见图1。

2.3 黑质Western blot电泳 与对照组相比，模型组p-Erk1/2明显降低(P=0.0052)，p-p38 MAPK(P=0.0053)、p-JNK明显增高(P=0.0000)。28醇中剂量和高剂量组p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达与模型组相比下降(P<0.05)，而28醇各组p-Erk1/2表达与模型组相比无显著性差异。见图2~图4。

表1 各组行为学指标比较

a:与对照组比较,P=0.0062 b:与模型组比较,P=0.0473 c:与模型组比较,P=0.0143 d:与模型组比较,P=0.0238

3 讨论

中国已进入老龄化社会，帕金森病已经成为影响老年人健康的一个突出问题，严重影响着老年人的身体健康和生活质量，也给家庭和社会带来巨大的经济和人力负担。目前帕金森病治疗仍以对症治疗为主，且多数化学药物不良反应较多，寻找新的治疗药物成为当前帕金森病研究的迫切需要。

28醇是一种从米糠蜡、甘蔗蜡等中提取的天然长链高级脂肪醇(CH3[CH2]27OH，分子量410.77)，可有效降低血清胆固醇水平，抗脂质过氧化，抑制血小板凝聚，抑制血管内皮平滑肌细胞的增生等[2]。Snider等[7]初步临床研究显示，一定剂量的28醇对帕金森病患者有一定的疗效；且28醇在体内吸收分布较快[8]，具有增强体力、精力和耐力，安全性和耐受性好等特点，这为帕金森病的临床治疗和干预提供了新的潜在单体药物。

针对临床上帕金森病患者的主要症状自发运动减缓、运动减少、静止震颤和运动协调能力下降等，我们在本研究中分别进行了相应的行为学检测，即转杆实验和自发运动实验，以此评价MPTP的毒性效应和28醇治疗效果。结果显示，MPTP对黑质-纹状体系统确切的毒性作用，给予28醇治疗可改善MPTP导致自发运动和运动协调能力损害。

形态学观察显示，MPTP注射2周后，小鼠黑质纹状体通路显著损伤，而28醇各治疗组均可不同程度逆转上述损伤。

MAPKs级联是细胞内重要的信号转导系统之一。细胞运用这一系统将胞外刺激信号传递给胞核，参与细胞生长、发育、分化和凋亡等一系列生理病理过程。到目前为止，在哺乳动物细胞中已至少发现3条主要的MAPK通路：细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路和p38 MAPK通路[9]。ERK信号通路通常被认为在生长因子介导的细胞增殖和分化过程中发挥重要作用，并可作为阻止细胞凋亡的存活因子；JNK及p38 MAPK为应激激活的蛋白激酶，可被细胞外多种应激原，如放射线、紫外线、热休克、高渗液和促炎因子等激活而启动凋亡相关信号通路。

多项研究显示，JNK和p38 MAPK参与了帕金森病的发病机制。例如JNK和p38 MAPK磷酸化形式在帕金森病患者尸检脑中被发现高表达[10]，JNK抑制因子(JNK interacting protein-1,JIP-1)或JNK活化抑制剂CEP-1347/KT-7515在MPTP动物模型中对多巴胺能神经元有神经保护作用[11-12]。在体外实验中，越来越多的研究表明，环境毒素鱼藤酮可以通过活化JNK和p38 MAPK诱导SH-SY5Y细胞的凋亡[13-14]；6-羟多巴胺可通过激活JNK信号通路诱导分化的PC12凋亡[15]。

本研究显示，模型组MAPKs家族3个信号通路因子活化形式中，MPTP可能通过介导p38 MAPK和JNK活化进而启动神经细胞凋亡过程，而Erk1/2介导的细胞增生和分化信号通路受到损害；28醇可通过调节MAPKs家族p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达，减少MPTP对黑质区神经元的损伤；28醇对Erk1/2介导的细胞增生和分化信号通路无明显作用。

本研究前期工作发现，28烷醇对6-OHDA致帕金森病大鼠模型具有神经保护作用，而其机制可能与其调节神经营养因子前体(proNGF)和神经营养因子(NGF)介导的细胞凋亡/存活通路相关。本研究在MPTP致帕金森病小鼠模型上验证28醇的行为学改善作用，黑质区MAPKs通路可能是其作用机制之一。结果显示，大剂量28醇(100 mg/kg)可以显著改善因MPTP神经毒性导致的四肢运动协调能力下降及自发运动次数减少，逆转MPTP对黑质区酪氨酸阳性多巴胺神经元的损伤；其神经保护机制可能与28烷醇降低黑质区MAPKs家族促凋亡因子蛋白表达有关。本系列研究为28烷醇成为抗帕金森病候选药物及其应用于抗帕金森病临床药物干预提供了理论依据。

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Effects of Octacosanol on Behavioral Impairments and Its Mechanism through MAPKs Pathway in MPTP-treated Mice

WANG Tao,LIU Yan-yong,YANG Nan,et al.Department of Neurobiology,Beijing Institute of Geriatrics,Xuanwu Hospital,Capital Medical University,Beijing 100053,China

ObjectiveTo investigate whether octacosanol would attenuate neurotoxicity in 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine(MPTP)-treated C57BL/6N mice and its potential mechanism.MethodsBehavioral tests,Nissl histochemistry and Western blot were used to investigate the effects of octacosanol in this mouse model of PD.ResultsOral administration of octacosanol(100 mg/kg)significantly improved behavioral outcome in mice induced by MPTP and markedly ameliorated morphological appearances of neuronal cells in striatum.Furthermore,octacosanol blocked MPTP-induced phosphorylation of p38MAPK and JNK,but not ERK1/2.ConclusionThe protective effects afforded by octacosanol might be mediated by blocking the phosphorylation of p38 MAPK and JNK on the signal transduction in vivo.

Parkinson's disease;neuroprotecion;behavior;mitogen-activated protein kinases;octacosanol

[本文著录格式]王涛，刘雁勇，杨楠，等.28醇对MPTP致帕金森病模型小鼠行为学的作用及其机制[J].中国康复理论与实践,2012,18(9):820-823.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.09.008

1.国家973基金项目(2010CB934002、2011CB504101、2011CBA00408)；2.国家自然科学基金资助项目(81050025)；3.北京市博士后工作经费资助项目。

1.首都医科大学宣武医院神经生物学研究室，北京市100053；2.中国医学科学院基础医学研究所药理室，北京市100005。作者简介：王涛(1980-)，男，辽宁大连市人，博士，助理研究员，主要研究方向：帕金森病药效学及机制研究。通讯作者：左萍萍。

R742.5

A

1006-9771(2012)09-0820-04

2012-05-28)

·临床观察·