香港远志提取物对拟阿尔茨海默病大鼠学习记忆的影响及机制

詹海涛， 李海燕， 曾煦欣， 吴剑峰

香港远志提取物对拟阿尔茨海默病大鼠学习记忆的影响及机制

詹海涛， 李海燕， 曾煦欣， 吴剑峰

目的 探讨香港远志提取物对拟阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆能力的影响及机制。方法

SD大鼠随机分4组:假手术组、模型组及治疗A、B组。双侧海马CA1区注射Aβ25～35建立拟AD大鼠模型，治疗组按设定方式给药，假手术组、模型组给1%吐温溶液。给药28d，Morris水迷宫方法测定大鼠学习记忆能力，定量分析海马区乙酰胆碱酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量。结果 与假手术组比较，模型组大鼠的学习记忆能力、SOD活力显著降低，AchE活力、MDA含量显著增高(P＜0.01)。与模型组比较，治疗组大鼠的学习记忆能力、SOD活力显著增高，AchE活力、MDA含量显著降低(P＜0.05，或P＜0.01)。结论 香港远志乙酸乙酯提取物，可有效改善拟AD大鼠学习和记忆功能障碍，作用机制可能与降低AchE活力、调节胆碱能系统平衡;降低MDA含量、增强SOD活力，减少氧自由基产生，缓解氧化应激损伤有关。

香港远志提取物; 阿尔茨海默病; 乙酰胆碱酯酶; 超氧化物歧化酶; 丙二醛

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以进行性记忆障碍为主要特征的中枢神经系统退行性病变，其逐年增高的发病率，已经成为严重危害人类健康的社会问题。目前，临床治疗AD仍缺乏理想的方法和药物。本研究采用β－淀粉样多肽25～35片断(Aβ25～35)诱导拟AD模型大鼠，观察香港远志提取物对大鼠行为学、脑组织中乙酰胆碱酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量的影响，探讨香港远志提取物对拟AD模型大鼠的治疗作用及其机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及分组 雄性健康SD大鼠40只，体重250～280g(广东省医学实验动物中心提供)，随机分4组:假手术组、模型组、香港远志提取物治疗A组及B组，每组10只。

1.1.2 香港远志提取物分离 香港远志全草，粉碎后用70%MeOH 65 L回流提取1.5h，共3次。合并提取液，减压回收溶剂，得浸膏悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取得提取物(100g全草萃取1g提取物)。

1.1.3 试剂及仪器 Aβ25～35(购于美国Sigma公司)，AchE、SOD、MDA试剂盒(购于南京建成生物工程研究所)，DYT2E型大鼠脑立体定位仪(购于中国天津医疗器械研究所)，756型紫外可见分光光度计(购于上海光谱仪器有限公司)，全自动Morris水迷宫及视频分析软件(购于上海吉量软件科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 AD模型制备及给药 用无菌生理盐水将Aβ25～35稀释成10μg/μl，37℃ 孵育72h，使其呈聚集状，4℃冰箱贮存备用。腹腔注射10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉大鼠，固定在脑立体定位仪，根据脑立体图谱，定位双侧海马CA1区，用牙科钻钻开颅骨，用微型进样器分别于模型组、治疗组大鼠双侧海马CA1区缓慢(6min内)注入Aβ25～35各1μl(10μg)，留针8min。假手术组以相同方式注射等量生理盐水，皮肤切口用青霉素粉剂消炎，缝合皮肤。AD模型制备后3d，治疗 A组、B组分别以50mg/kg/d及100mg/kg/d剂量灌胃给药28d，(每天1次，用时将香港远志提取物以1%吐温溶液配成所需浓度)。假手术组、模型组给等量1%吐温溶液。各组大鼠室温(23～25℃)下自由进食、进水。

1.2.2 学习记忆能力测定 给药28d后，应用Morris水迷宫行为学方法［1］测定各组大鼠学习记忆能力。由大鼠入水后搜索及爬上平台所需的时间确定逃避潜伏期(单位:s)。如在1min内大鼠找不到平台，则由实验者将其引上平台，其逃避潜伏期为1min，在1min内找到平台的大鼠，按实际时间确定其逃避潜伏期。

1.2.3 脑组织AchE、SOD、MDA测定 完成学习记忆能力测定后，以颈椎脱臼法处死各组大鼠，断头取脑，分离出海马及周围组织，用冰冷生理盐水漂洗，滤纸拭干，称重，将剪碎的脑组织块倒入匀浆器中，用冰冷生理盐水配制成10%脑组织匀浆。按AchE、SOD、MDA试剂盒的操作要求，用比色法测定。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行分析，数据以±s表示，两样本间比较用t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 学习记忆能力测定 各组大鼠Morris水迷宫实验的平均逃避潜伏期，均随测试日期延伸而渐缩短。与假手术组比较，实验记录的1、2、3d，模型组的平均逃避潜伏期均显著增长(P＜0.01);与模型组比较，治疗组各时间点的平均逃避潜伏期显著缩短(A组:P＜0.05，B组:P＜0.01)，见表1。

2.2 脑组织AchE、SOD、MDA测定 与假手术组比较，模型组AchE活力、MDA含量显著增高，SOD活力显著降低(P＜0.01);与模型组比较，治疗组AchE活力显著降低(B组:P＜0.05)、MDA含量显著降低(A组:P＜0.05，B组:P＜0.01)、SOD活力显著增高(A组:P＜0.05，B组:P＜0.01)，见表2。

表1 香港远志提取物对拟AD模型大鼠水迷宫逃逸潜伏期的影响(±s，t/s)

表1 香港远志提取物对拟AD模型大鼠水迷宫逃逸潜伏期的影响(±s，t/s)

与假手术组比较*P＜0.01;与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 n 1d 2d 3d假手术组模型组治疗A组治疗B组10 10 10 10 21.96±9.81 46.78±14.37* 33.12±12.97△25.26±10.13△△13.25±6.15 37.69±13.49* 26.14±10.54△20.51±9.14△△11.62±5.97 30.84±12.31* 20.73±8.29△14.17±7.31△△

表2 香港远志提取物对拟AD模型大鼠脑组织AchE、SOD、MDA的影响(±s)

表2 香港远志提取物对拟AD模型大鼠脑组织AchE、SOD、MDA的影响(±s)

与假手术组比较*P＜0.01;与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 n AchE(u/mg) SOD(u/mg) MDA(nmol/mg)假手术组模型组治疗A组治疗B组10 10 10 10 0.38±0.13 0.77±0.31* 0.53±0.24 0.49±0.21△127.95±8.43 79.76±5.74* 85.45±6.16△90.61±7.05△△3.61±0.44 8.15±0.87* 7.58±0.61△7.14±0.59△△

3 讨论

由于AD的病因、发病机制目前尚未完全阐明，临床缺乏理想的防治措施，因此，在探究AD病因、发病机制并不断阐明新的分子作用靶点基础上，开发疗效确切的防治药物，仍需大量深入的药物筛选、药效和作用机制研究。在此领域，中药因成本低、分子作用靶点广、毒副作用少等优势［2］，具独特的开发应用前景。远志属的多种植物在文献古籍中具有安神益智作用，现代药理学研究表明其具有提高学习记忆力、脑保护和抗痴呆作用。香港远志(Polygala hongkongensis Hemsl)系远志科(Polygalaceae)远志属植物，民间以全草入药，具有活血、化瘀、解毒之功效［3］，新近的体外研究证实其具有抗氧化作用［4，5］。本研究首次选用香港远志乙酸乙酯提取物，探究其对拟AD模型大鼠学习记忆障碍的治疗作用及作用机制，为开发防治AD新药提供研究资料。

AD早期的病理改变是Aβ在脑内沉积，海马结构是AD最早、最易受损的部位［6］。研究证实，脑内注射Aβ可使动物产生拟AD的记忆缺损症状［7］，本研究采用大鼠双侧海马注射聚集状Aβ25～35，拟脑内Aβ沉积，建立AD大鼠模型。应用Morris水迷宫行为学方法，测定各组大鼠学习记忆能力。结果表明，模型组的平均逃避潜伏期较假手术组显著增长，提示大鼠出现显著的学习和记忆功能障碍。与模型组比较，治疗组的平均逃避潜伏期随药物剂量的增大而显著缩短，提示香港远志提取物对拟AD大鼠学习和记忆功能障碍，有良好的改善作用。

中枢胆碱能系统是调节学习和记忆功能的主要通路，研究显示，ACh是通过膈区－海马－边缘叶和大脑皮质两条通路，发挥特异性调节第一级记忆转入第二级记忆的神经递质［8］。AchE是ACh的降解酶，其主要生理功能是水解ACh生成胆碱和乙酸，终止胆碱能突触间的脉冲传递，维持胆碱能系统功能的平衡。胆碱能神经元退化、ACh含量不足、AchE活性升高导致的该系统功能紊乱，是AD的重要发病机制之一。由于目前仍难于准确测定ACh含量，许多研究应用AchE活性测定间接反映ACh代谢情况。本研究结果显示，模型组AchE活力较假手术组显著增高，表明拟AD大鼠出现的学习和记忆障碍与海马区AchE活力增高有关。与模型组比较，治疗组AchE活力，随药物剂量的增大显著降低，表明香港远志提取物改善拟AD大鼠认知和记忆障碍的作用机制，可能与降低AchE活力、调节胆碱能系统平衡、恢复其生理功能有关。

研究表明，Aβ可能因其本身既是氧自由基供体或诱导生成活性氧发挥神经毒性作用［9］从而导致体内自由基产生与清除的生理平衡紊乱。脑组织对氧的高度依赖性及富含不饱和脂肪酸，使其成为最易遭受自由基毒性作用的部位。自由基链式反应和脂质过氧化作用，主要损伤灰质神经元，抑制甚至丧失蛋白的生理性功能，导致细胞变性、死亡。SOD是机体清除自由基的关键酶，其抗氧化功能在防御自由基的损伤中发挥重要作用。脂质过氧化物的分解产物是MDA，测定其含量可反映体内脂质过氧化程度，间接反映组织细胞的受损程度［10］。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组MDA含量显著增高，SOD活力显著降低，表明氧化应激参与了拟AD的形成过程，大鼠出现的学习和记忆障碍，与其体内自由基产生与清除的平衡紊乱有关。与模型组比较，治疗组随药物剂量的增大，MDA含量显著降低、SOD活力显著增高，提示香港远志提取物，通过恢复机体氧化还原体系平衡，提高机体抗氧化能力，改善拟AD大鼠的认知和记忆功能障碍。

本研究结果表明，香港远志乙酸乙酯提取物，可有效改善拟AD大鼠学习和记忆功能障碍，其作用机制可能与降低AchE活力、调节胆碱能系统平衡;增强SOD活力、降低MDA含量，恢复氧化还原体系平衡，提高机体抗氧化能力等有关。进一步明确其调节胆碱能系统与氧化还原体系的内在关系，有待今后深入研究。

［1］Nakashima Y，Ohsawa I，Konishi F，et al.Preventive effects of Chlorella on cognitive decline in age－dependent dementia model mice［J］. Neurosci Lett，2009，464(3):193－198.

［2］Man SC，Durairajan SS，Kum WF，et al.Systematic review on the efficacy and safety of herbal medicines for Alzheimer’s disease［J］.J Alzheimers Dis，2008，374(14):209－223.

［3］阴 健，郭力弓.中药现代研究与临床应用［M］.第3卷.北京:学苑出版社，1993.336－339.

［4］Wu JF，Chen SB，Gao JC，et al.Antioxidants and a new dihydroisocoumarins from Polygala hongkongensis Hemsl［J］.Natural Prod Res，2007，21(7):580－584.

［5］Wu JF，Chen SB，Gao JC，et al.Xanthone glycosides from herbs of Polygala hongkongensis Hemsl and their antioxidant activities［J］.A－sian Nat Prod Res，2008，10(7):665－670.

［6］Daulatzai MA.Early stages of pathogenesis in memory impairment during normal senescence and Alzheimer’s disease［J］.J Alzheimers Dis，2010，20(2):355－367.

［7］Huang HJ，Liang KC，Chen CP，et al.Intrahippocampal administration of Aβ1－40 impairs spatial learning and memory in hyperglycemic mice［J］.Neurobiol Learn Mem，2007，87(4):483－494.

［8］秦海强，李 亚，田苏平，等.B－淀粉样蛋白及D－半乳糖对大鼠学习记忆和胆碱酯酶活性的影响［J］.南京医科大学学报，2000，20:195.

［9］Smith DG，Cappai R，Barnham KJ.The redox chemistry of the Alzheimer’s disease amyloid beta peptide［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1768(8):1976－1990.

［10］Choudhary M，Jetley UK，Abash Khan M，et al.Effect of heavy metal stress on proline，malondialdehyde，and superoxide dismutase activity in the cyanobacterium Spirulina platensis－S5［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2007，66(2):204－209.

Effect and mechanism of polygala hongkongensis hemsl extracts on learning and memory in Alzheimer’s disease model rats

ZHAN Hai－tao，LI Hai－yan，ZENG Xi－xin，et al.(Medical College of Foshan University，Foshan528000，China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of polygala hongkongensis hemsl extracts(PHHE)on learning and memory in Alzheimer’s disease(AD)model rats.MethodSD rats were randomly divided into 4 groups，sham operated group，model group and treatment group A and B.The amyloid－β25～35 was injected into the hippocampus to induce AD models.Treatment groups

drug respectively according to grouping protocol，while the sham operated group and model group received 1%tween－80 solution.After 28 days with PHHE intervention，the learning and memory abilities were measured by water maze，and the AchE，SOD and MDA in the hippocampus region were quantified.ResultsCompared with sham operated group，the learning and memory abilities and the activity of SOD were obviously decreased，the activity of AchE and MDA were obviously increased in model group(P＜0.01).Compared with model group，the learning and memory abilities and the activity of SOD were obviously increased，the activity of AchE and MDA was obviously decreased in treatment groups(P＜0.05 orP＜0.01).ConclusionPHHE can effectively improve the ability of learning and memory in AD model rats，which may be achieved by inhibiting the activity of AchE，promoting the restore of choline nervous system function，reducing the quantity of MDA，increasing the activity of SOD，reducing toxic free radical and relaxing oxidative injury.

Polygala hongkongensis hemsl extracts;Alzheimer’s disease;Acetylcholinesterase;Superoxide dismutase;Malondialdehyde

R749.1+6

A

1003－2754(2012)03－0243－03

2011－11－16;

2012－01－18

广东省自然科学基金资助项目(No.9151064201000042)

(佛山科学技术学院医学院，广东佛山528000)

吴剑峰，E－mail:jianfeng839@sina.com