氯沙坦对机械通气大鼠肺组织TNF-α和MPO表达的影响

牛志红，张新日

(山西医科大学第一医院呼吸科，太原 030001)

呼吸机所致肺损伤(ventilator-induced lung injury，VILI)是机械通气最严重的并发症，研究其发病机理和防治措施对提高机械通气应用水平有重要价值。近年来研究发现，肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)不但在急性肺损伤(ALI)时炎症反应、氧化应激和细胞凋亡中发挥了重要作用，而且在 VILI发病中也具有重要作用［1-4］。因此，适当应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体拮抗剂或血管紧张素转化酶抑制剂对VILI应具有一定防治作用。本实验通过观察氯沙坦对机械通气大鼠肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达量及髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性的影响，探讨氯沙坦对机械通气肺损伤的抗炎保护作用。

1 材料和方法

1.1 动物分组与模型制备

健康成年雄性 W ister大鼠24只(山西医科大学动物中心提供，合格证号：SXCK(晋)2009—0001，清洁级)，体重300g～350g，随机分为3组：①对照组：未行机械通气；②呼吸机致肺损伤组(VILI组)：潮气量40m L/kg；③氯沙坦干预组(LAP组)：机械通气前30min腹腔注射氯沙坦30mg/kg。

大鼠经25%的乌拉坦4m L/kg腹腔注射麻醉后行气管切开。除对照组外，其余大鼠均通过橡胶管与小动物呼吸机(DH-150型，浙江大学医学仪器厂制造)相连接行机械通气。通气参数：潮气量 40m L/kg，频率 60次/min，吸/呼比 1∶3，PEEP为0，吸入气体为室内空气，通气时间为2h。

通气结束后，腹主动脉放血将大鼠处死，切取肺脏，肉眼观察肺脏的大体改变，取右肺中叶用中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，行HE染色病理学检查及TNF-α免疫组织化学染色检测。取右肺中叶行肺湿/干重(W/D)比值测定。取左肺上叶-20℃保存，用于 AngⅡ含量测定。取左肺下叶-20℃保存，用于MPO活性测定。

1.2 肺组织TNF-α免疫组织化学染色

采用链霉亲和素-生物素-过氧化酶复合物法(SABC)对肺泡上皮细胞和细支气管上皮细胞进行TNF-α免疫组织化学染色，具体操作步骤参照试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)说明进行。兔抗大鼠抗体工作浓度为1∶100，以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。结果判断：阳性染色为细胞浆内出现棕黄色颗粒。在400倍光镜下对每张组织切片随机选取5个高倍视野进行观察。采用 BI-2000医学图像分析系统分别检测每个视野 TNF-α染色阳性细胞的平均光密度值(A)，以上述5个视野的平均值作为该大鼠细支气管上皮细胞 TNF-α蛋白表达的相对含量。

1.3 肺组织W/D比值测定

取右肺中叶用生理盐水冲洗干净表面血迹，再用无菌纱布吸干表面液体后称重(湿重)，然后置于烤箱中 60℃过夜后再称重(干重)，计算肺湿/干(wet/dry，W/D)比值。

1.4 肺组织匀浆AngⅡ含量检测

将肺组织称重后置于裂解液中，用组织匀浆机打碎后离心，取上清液用 ELISA法测定肺组织中AngⅡ含量。AngⅡ ELISA试剂盒由美国 GBD公司提供，操作过程严格按试剂说明书进行。先在酶标仪(Wellscan Mk3，芬兰)上测出标准品吸光度并绘制出标准曲线，然后测定样品吸光度并在标准曲线上读出样品浓度。

1.5 肺组织匀浆M PO活性测定

将肺组织称重后制备组织匀浆，采用髓过氧化物酶检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定肺组织中MPO活性。测定方法及操作步骤按试剂盒说明进行。

采用721分光光度计进行比色，波长460nm，光径1cm，蒸馏水调零，测定各管吸光度值。MPO活性用酶活力单位表示，即每克组织蛋白在37℃的反应体系中使H2O2分解1μmol为1个酶活力单位。

文氏桥振荡器,它是由同相放大器和RC串并联反馈网路组成。具有振荡较为稳定、波形良好、振荡频率在较宽的范围能方便地连续调节等优点[6]。在文氏桥振荡器拓扑中增加动态元件、非线性元件或者两个文氏桥电路通过非线性耦合可构成各类文氏桥混沌或超混沌振荡电路[10-14]。

1.6 统计学方法

全部数据以均数±标准差表示，采用SPSS 11.5软件包进行统计学分析，组间差异比较采用方差分析，各组均数间两两比较用 SNK-q检验，相关性分析采用直线相关分析法，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学改变

HE染色光镜下观察，对照组大鼠肺泡结构和各级支气管上皮完整，肺间质无明显炎症细胞浸润。VILI组大鼠可见弥漫性肺间质水肿和炎症细胞浸润，肺泡间隔增厚，部分肺泡破裂融合，小血管断裂，肺泡腔内有血性液体渗出。LAP组大鼠也可见到肺间质水肿和炎症细胞浸润，但较VILI组明显减轻(图1～3见彩插5)。

2.2 肺湿/干比值测定结果

各组大鼠肺湿/干重比值(W/D)测定结果见表1。结果显示，VILI组大鼠肺W/D比值均明显高于对照组和LAP组(均 P＜0.01)；VILI组与对照组比较无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 肺组织AngⅡ含量检测结果

2.4 肺组织TNF-α免疫组织化学染色测定结果

各组大鼠肺组织细支气管上皮细胞TNF-α免疫组织化学染色测定结果见表1和图4～6，(图1～6见彩插5)。结果显示，VILI组大鼠肺组织TNF-α表达水平明显高于对照组和LAP组(均P＜0.01)；LAP组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.5 大鼠肺组织匀浆中M PO活性测定结果

各组大鼠肺组织匀浆中MPO活性测定结果见表1。结果显示，VILI组大鼠肺组织匀浆中MPO活性明显高于对照组和LAP组(均P＜0.01)；LAP组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.6 肺组织TNF-α蛋白表达与AngⅡ含量的相关性分析

相关分析结果表明，对照组与VILI组大鼠肺组织TNF-α蛋白表达与肺组织AngⅡ含量之间呈正相关(r=0.681，P＜0.05)。

表1 各组肺湿/干比重、AngⅡ含量、TNF-α表达水平及MPO活性的比较(±s)Tab.1 Comparison of W/D，AngⅡ content，TNF-α level and MPO activity in all groups(±s)

表1 各组肺湿/干比重、AngⅡ含量、TNF-α表达水平及MPO活性的比较(±s)Tab.1 Comparison of W/D，AngⅡ content，TNF-α level and MPO activity in all groups(±s)

注：与对照组比较：*P＜0.01；与 VILI组比较：#P＜0.01；与对照组比较，##P＜0.01。NOTE：*P＜0.01，compared with the control group；#P＜0.01，compared with the VILI group；##P＜0.01，compared with the control group.

检测指标(Indexes)对照组(Control group) VILI组(VILI group) LAP组(LAP group)例数n 888肺湿/干比重(W/D) 4.389±0.065 8.546±0.374* 4.711±0.194# AngⅡ含量(AngⅡcontent) 112.051± 7.777 451.159± 19.803* 457.660± 15.660## TNF-α水平(TNF-α level) 0.133±0.017 0.655±0.029* 0.166±0.023# MPO活性 U/L (MPO activity) 1.638±0.027 6.762±0.423* 1.677±0.026#

3 讨论

近年来，肾素-血管紧张素系统(RAS)在急性肺损伤中的作用引起了人们的广泛关注。大量研究表明，RAS主要成分-AngⅡ及其受体活性与急性肺损伤的发生密切相关［1-3］。AngⅡ作为一种致炎因子可调控多种炎症细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8等在肺组织中表达，是引起急性肺损伤的重要原因之一。Ruiz-Ortega等［5］研究发现，ALI时多种炎症细胞在肺内募集、活化，通过激活RAS产生大量AngⅡ。后者又可加剧肺部炎症反应，从而形成恶性循环，最终导致肺组织损伤［6］。

研究证实，RAS在 VILI发病中也具有重要作用［7］。机械通气可直接或间接激活RAS系统，使其效应物质AngⅡ表达增多。AngⅡ通过激活炎症细胞产生一系列炎症细胞因子，这些炎症细胞和细胞因子相互作用，构成庞大而复杂的网络体系，是引起肺生物伤的主要原因［5］。

在众多的细胞因子中，TNF-α是炎症反应中最主要的促炎因子，可介导急性肺损伤时中性粒细胞在肺部聚集和活化，并启动炎症反应级联放大效应。研究表明［8］，在机械通气肺损伤早期即可出现TNF-α高表达，提示TNF-α可能是引起炎症反应的始动因素。然而，TNF-α表达是通过何种途径来调控的目前尚不完全清楚。本实验结果显示，VILI组大鼠肺组织AngⅡ含量及TNF-α水平表达明显高于对照组，而且TNF-α蛋白表达与AngⅡ含量呈正相关。说明AngⅡ作为肺部炎症反应复杂网络中的一个关键物质，对调控TNF-α表达有重要作用。

目前认为，AngⅡ介导肺部炎症反应的主要受体是AT1受体［7］。动物实验研究表明，在各种原因所致的急性肺损伤中，肺组织中 AngⅡ及其受体AT1的表达水平均显著增高［3.9，10，］。因此我们推测，AngⅡ所介导的VILI发病过程有可能是通过AT1受体来实现的，因此，阻断 AngⅡ与 AT1结合对防治VILI发生至关重要。

氯沙坦是一种二苯四咪唑类 AT1型受体拮抗剂，具有选择性好，特异性高等特点，可特异性阻断AngⅡ与AT1结合而发挥拮抗作用。研究表明，氯沙坦不仅具有抗炎作用，而且还有抗氧化和防止细胞凋亡等作用［10，11］。本实验结果显示，氯沙坦干预组大鼠肺组织AngⅡ含量与VILI组比较无明显差异，但肺组织TNF-α蛋白表达水平、肺组织匀浆中MPO活性和肺W/D比值均较VILI组明显降低，同时，肺组织病理损伤程度也较VILI组明显减轻。说明氯沙坦可通过阻断AngⅡ与AT1受体结合而抑制TNF-α的表达，减轻肺组织炎症性损伤，对 VILI具有一定保护作用。

综上所述，AngⅡ通过调控肺组织中TNF-α的表达在VILI发病中起着重要作用，氯沙坦可阻断AngⅡ与AT1受体的结合，抑制 TNF-α的表达，对VILI具有一定防治作用，但AngⅡ通过何种信号转导途径来调控TNF-α表达尚有待深入研究。

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