唾液酸受体并非流感病毒各亚型在雪貂组织中播散分布的决定因子

占玲俊，邓 巍，鲍琳琳，吕 琦，李枫棣，马春梅，许黎黎，秦 川

(卫生部人类疾病比较医学重点实验室 国家中医药管理局人类疾病

动物模型三级实验室 中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100021)

雪貂是研究流感病毒的理想动物模型，但是不同亚型流感病毒感染雪貂后在组织中的分布情况如何，目前还没有详尽系统的数据。而病毒在宿主体内的分布是流感病毒致病机制研究以及药物和疫苗安全评价不可或缺的资料。

病毒在宿主体内的播散和分布机制比较复杂，目前还未见系统的明确的报道。主要的影响因素包括：流感病毒的唾液酸受体的表达和分布；流感病毒蛋白HA上碱性酶切割位点的可切割性；宿主体内能切割流感病毒使其能播散的酶，以及其它的相关酶［1-3］。

流感病毒的受体是唾液酸的糖链，糖链以糖脂和糖蛋白的形式存在于细胞表面。唾液酸在动物细胞表面广泛分布，不同物种其衍生物分子种类及其与半乳糖及连接键型不同。大多数禽流感病毒优先识别结合于 SAα2，3Gal，人流感病毒优先结合于SAα2，6Gal。其中SAα2，3Gal根据糖链β链的链接又分为 SAa2，3-Galβ(1-4)GlcNAc和 SAa2，3-Galβ(1-3)GlcNAc，分别与凝集素 MAAI和 MAAII结合，SAα2，6Gal则与SNA结合［1］。

本研究中将着重探讨流感病毒H5N1，SH1N1，H3N2感染雪貂后在各组织中的分布，并用免疫荧光和共聚焦荧光显微镜分析组织上唾液酸受体的分布，并探讨唾液酸受体分布与病毒在组织中分布的关系。

1 材料和方法

1.1 病毒

禽流感病毒 H5N1(A/VN/1203/04)、H5N1(SZ406H/06)、 H3N2(Brisbane/09)、 H3N2(Hongkong/09)和swine H1N1由本研究室保存。病毒在10日龄的鸡胚上传代后，测定病毒的滴度备用。

1.2 流感病毒感染雪貂

雪貂经兽用氯胺酮轻度麻醉后，将流感A/HK/09 H3N2病毒株以 106TCID50，A/BR/09以 106TCID50，A/SZ/406H/06H5N1病毒株以102TCID50， A Vietnam/1203/2004以104TCID50每只雪貂鼻孔内均匀滴入400μL病毒液。感染前0d采集鼻甲骨活检，感染后1～5d鼻甲骨活检检测病毒载量和病毒滴度。感染后第5天处死雪貂，取雪貂的肝脾肺肠脑等组织做病毒滴度测定和免疫荧光。

1.3 样品的采集和组织匀浆

感染后第5天，用氯胺酮麻醉雪貂，然后无菌操作取雪貂的组织脏器，包括心、肝、脾、肺、肾、肠、脑等，一部分样品放在10%的中性福尔马林中固定，一部分放到含1% 青-链霉素DMEM中，另一部分组织放入-80℃冻存备用。4%甲醛溶液固定的组织用石蜡包埋，切成5μm的组织切片，用于后面的免疫荧光和病毒与受体结合的分析。DMEM中组织用电动研磨器(Pro200，USA)研磨，2000r/min，10min离心后取上清液，用于病毒分离。

1.4 组织活病毒分离

将100μL组织匀浆10倍稀释接种于MDCK细胞。每个滴度接种5个复孔。放37℃ CO2孵箱中吸附1h，补加DMEM培养基放入孵箱培养48h。从每孔中吸取50μL上清液至另一个96孔板中。每孔加入1%火鸡血50μL，30m in观察结果。结果按Reed-Muench法计算样品的TCID50。

1.5 组织上唾液酸受体的检测

石蜡包埋的组织切片脱蜡水合后，用PBS洗3遍，分别加入 FITC标记的SNA和 MAA I(Vector laboratory)，浓度为10μg/m L，以及 TRITC标记的MAAII(EY lab)，浓度为50μg/m L。作为对照，加入唾液酸酶A(pH 6.0)，37℃作用24h，唾液酸酶能切割非还原性的末端唾液酸残基，优先顺序为：a (2，6) ＞a(2，3) ＞a(2，8) ＞a(2，9)。PBS洗3遍后，加入荧光标记的凝集素SNA、MAAI和 MAA II，与酶切过的组织4℃孵育过夜，而阴性对照组织片不加入荧光标记的凝集素。在共聚焦荧光显微镜下观察凝集素的结合。

1.6 活病毒与组织的结合

石蜡包埋的肺组织切片在二甲苯中脱蜡，然后在乙醇中水合。水合的组织切片放入盛有枸橼酸钠溶液中，微波炉中高火3min，停1min再中火7 m in进行抗原修复。加入TPCK处理过的活病毒到组织切片上，37℃孵育24h，其中各加入100TCID50的H5N1和SH1N1与组织进行孵育。孵育后，用羊血清封闭30min。分别加入1∶10000和1∶200的鼠源性抗流感病毒的单克隆抗体孵育，4℃过夜。加入1∶200稀释的FITC标记的羊抗鼠的二抗，室温避光孵育2h。用 TBS洗3次后，加入细胞核染色的荧光染料DAPI，共聚焦显微镜观察活病毒结合的细胞定位。

2 结果

2.1 各亚型流感病毒在感染的雪貂各组织脏器中的分布

温和的流感病毒 H1N1(CA7)和 H3N2(HK，BR)感染雪貂后，只能在肠道中分离到活病毒。而禽流感病毒 H5N1(SZ)感染雪貂后，在雪貂的肝、脾、肺、肠中均能分离到活病毒，但脑组织中未分离到活病毒；H5N1(Vietnam)感染雪貂后，肝、脾、肺、肠、脑组织中均能分离到活病毒。由此可见，高致病性禽流感能侵袭易感动物的多组织脏器，其中H5N1(Vietnam)在雪貂中侵袭的组织比H5N1(SZ)广泛，并且肝、脾、肺、肠组织中病毒的滴度高于H5N1(SZ)，说明前者对雪貂的毒力大于后者(表1)。

表1 各亚型流感病毒感染的雪貂各组织的病毒分离结果(单位：log10 TCID50)Tab.1 Virus isolated from tissues of the influenza virus-infected ferrets.(Unit：log10 TCID50)

2.2 雪貂各组织中唾液酸受体的分布

利用直接荧光法利用FITC标记的SNA检测唾液酸受体 SAa2，6-Gal，而 FITC标记的MAA I和TRITC标记的MAA II分别检测唾液酸受体SAa2，3-Galb(1-4)GlcNAc和 SAa2，3-Galb(1-3) GalNAc。

雪貂的主要组织脏器肺、肝、肾、肠、脾、心、脑组织分别做免疫荧光，通过荧光共聚焦观察，发现上述组织上均有唾液酸受体的分布，其中SNA阳性代表SAa2，6-Gal表达阳性，MAAI和MAAII阳性分别代表SAa2，3-Galb(1-4)GlcNAc和 SAa2，3-Galb (1-4)GlcNAc表达阳性(表2)。

其中支气管、肺、肾、回肠和盲肠的唾液酸受体分布的荧光共聚焦结果最典型，如图1～3。其中图1A是肺泡和细支气管上唾液酸受体的分布情况，图1B是支气管上唾液酸受体的分布。可见支气管，细支气管和肺泡上 SAa2，6-Gal，SAa2，3-Galb(1-4) GlcNAc和SAa2，3-Galb(1-4)GlcNAc均有分布(图1A，图1B，见彩插2。表2)。肾脏上上述3种亚型的受体也均有分布 (图2、图3A见彩插3)。而回肠和结肠上仅有SAa2，6-Gal和Aa2，3-Galb(1-4) GlcNAc表达(图3B、图4见彩插4)。对照各组织的病理切片，可以明确免疫荧光的组织切片上的阳性表达细胞类型(表2)。

表2 雪貂各组织脏器上唾液酸受体的分布Tab.2 Sialic acid receptor distribution in the tissues of ferret

2.3 流感活病毒与组织切片上唾液酸受体的结合

流感病毒H1N1可以与SAa2，6-Gal受体结合，而H5N1则可以和SAa2，3-Gal受体结合。通过组织切片的间接免疫荧光结果可以看出，H1N1主要是与支气管上皮细胞上 SAa2，6-Gal受体结合，而H5N1则主要与支气管肺泡细胞上 SAa2，3-Galb(1-4)GlcNAc结合。而这些阳性细胞与同一组织上唾液酸分布的成镜像吻合(图3B、图4见彩插4)。

3 讨论

不同亚型流感病毒感染雪貂后，病毒在各组织中的分布不一样，病毒滴度也存在差异。其中温和型的流感病毒只在肠道中增殖，而禽流感病毒则可以在肝、脾、肺、肠、脑等多组织中繁殖。同一种亚型流感病毒感染雪貂后，不同组织病毒的分布不一样，可能与唾液酸受体有关，也可能与宿主其它的限制因子有关，比如宿主酶。

上呼吸道作为流感感染的门户，其唾液酸受体［SA(α-2，3)，SA(α-2，6)］的分布被重点关注。关于SA受体的分布的研究，Yasuo Suzuki等的研究发现唾液酸受体是流感病毒侵袭不同宿主的决定因子［1］，Nicholls的研究证明人呼吸道唾液酸受体分布是人源性和禽源性流感病毒广泛播散的基础［1，4］。

本研究发现，唾液酸受体在雪貂的主要组织脏器如心、肝、脾、肺、肾、肠、脑等组织均有分布，但是活病毒并没有在相应的各组织均有分布，尤其是人流感病毒和某些温和的流感病毒。另外，体外活病毒与组织上唾液酸受体的结合，可以证实上述受体检测结果的特异性和活性。由此可见，唾液酸受体并不是流感病毒在雪貂各组织分布的决定因子，而可能只是其中的条件之一。或者还有其它的受体和共受体。

高致病性的流感病毒(如H5N1)可以被普遍存在各组织的蛋白酶切割，其中最有可能的是一种重要的前体蛋白内切酶弗林蛋白酶(furin)［5］。这种弗林蛋白酶使流感病毒具有组织泛向性，使流感病毒可以在动物的许多组织中进行复制，损害动物重要的器官和组织，导致受感染的鸟类发生疾病和死亡。另外，还发现枯草杆菌蛋白酶也有切割多碱基位点的特性，并促进病毒在宿主体内广泛繁殖和传播［2，3，6］。

而LPAI、季节性流感病毒H3N2、H1N1和甲流H1N1在组织中分布于呼吸道和肠道，Bottcher及其同事发现人肺来源的丝氨酸跨膜蛋白2(TMPRSS2)和人呼吸道胰酶样蛋白酶(HAT)能促进人流感病毒的传播［3，7，8］，而 Chaipan等［9］发现丝氨酸跨膜蛋白2和4(TMPRSS2，TMPRSS4)能激活1918年H1N1的HA，由此可见作为内源性表达的酶TTSP(TMPRSS2，TMPRSS4)能活化HA并在外源性胰酶缺乏的情况下促进流感病毒在组织脏器间传播。

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