“纸层析法鉴定酶促转氨基作用”实验方法的改进

2012-01-30李凤鸣谭秀山许先查

中国畜牧兽医文摘 2012年6期

关键词：层析氨基学报

李凤鸣谭秀山许先查王鹤

（1.新疆农业大学动物营养实验室，乌鲁木齐 830052；

2.新疆职业大学烹饪与餐饮管理学院，乌鲁木齐 830013）

“纸层析法鉴定酶促转氨基作用”实验方法的改进

李凤鸣1谭秀山2许先查1王鹤1

（1.新疆农业大学动物营养实验室，乌鲁木齐 830052；

2.新疆职业大学烹饪与餐饮管理学院，乌鲁木齐 830013）

试验比较研究了13种展层剂对氨基酸的分离效果并验证了其在酶促转氨基试验中对氨基酸的分离效果。结果表明展层剂无水乙醇-水-尿素（80：20：0.5，V/V/W）氨基酸分离效果明显，且无毒害作用，能够替代传统试验中水饱和酚。

展层剂氨基酸纸层析

“纸层析法鉴定酶促转氨基作用”试验中分离氨基酸时常用的展层剂是水饱和苯酚[1]（水：酚=1：2，v/v），但苯酚挥发性大，具有强烈的刺激气味，对皮肤、呼吸道有腐蚀作用，危害教师及学生的身体健康。人们也在不断尝试新的安全且分辨效果好的展层剂，用于替代水饱和苯酚，但其效果在试验中表现参差不齐。本文总结了近10年文献报道中用于氨基酸分离的13种展层剂并对其分离氨基酸的效果进行了试验。

1 材料与方法

1.1 展层剂的筛选试验

1.1.1 展层剂的筛选

根据相关的文献，我们选择了相应的展层剂进行筛选。展层剂的组成见表1。

1.1.2 试剂 1%（w/v）谷氨酸溶液、1%（w/v）丙氨酸溶液以及谷、丙氨酸混合溶液。

1.1.3 滤纸将层析滤纸剪裁为5cm× 16cm，备用。

1.1.4 显色剂 0.1%（W/V）茚三酮的乙醇溶液。

1.1.5 步骤采用周顺伍主编《动物生物化学试验指导》中纸层析法鉴定酶促转氨基作用中的上行法。

1.2 展层剂在纸层析法鉴定酶促转氨基作用中的应用

根据1.1展层剂的筛选试验的结果，选择分离效果明显的展层剂用于纸层析法鉴定酶促转氨基作用，以验证展层剂展层效果。

试验方法及步骤参见周顺伍主编《动物生物化学试验指导》。

1.2.1 酶液制备，取新鲜肝脏5 g，加0.9%NaCl溶液1 ml，在乳钵中研磨，再加0.9%NaCl溶液1 ml，继续研磨成匀浆，最后加入0.9%NaCl溶液5 ml混匀，3 000 r/min，5 min离心，取上清液，即为肝脏糜提取液（含有转氨酶）。

1.2.2 取2支试管分别编号为1、2，分别加入20滴肝脏糜提取液，并将1号管在沸水浴中煮沸2 min，以破坏酶活。再分别加入10滴1%谷氨酸溶液、10滴1%丙酮酸溶液、10滴0.1%KHCO3溶液和5滴0.25%溴乙酸溶液，混匀，37°C水浴1 h后加入4滴2%醋酸溶液摇匀并水浴加热至蛋白质全部沉淀。分别用滤纸过滤，滤液备用。

1.2.3 层析方法同1.1。

1.3 Rf值的计算：按下式计算氨基酸的Rf值

Rf=原点到层析样品点中心的垂直距离／原点到溶剂最前沿的垂直距离

2 结果与讨论

2.1 展层剂筛选的试验结果

13种展层剂筛选的试验结果见表2。

由表2可知3号、10号以及13号展层剂均能够将氨基酸分离，且谷、丙氨基酸分离效果明显；分离时间分别为57 min、72 min、69 min。

表1 展层剂的组成

表2 展层剂的筛选试验结果

表3 纸层析法鉴定酶促转氨基作用的试验结果

2.2 纸层析法鉴定酶促转氨基作用的验证试验

经转氨作用后，氨基酸在各种展层剂中的迁移率见表3。

由表3可以看出，3、10、13号展层剂均能有效分离将氨基酸分离，3号、10号以及13号展层剂中谷氨酸、丙氨酸Rf的差值分别为0.26、0.21、0.36，展层时间分别为60 min、68 min、75 min。Rf的差值越大，分离效果越明显。3号展层剂的分离效果明显优于10号，但不及13号展层剂，但在分离时间上3号展层剂的展层时间最短。

从展层效果以及展层时间综合考虑，3号展层剂即无水乙醇∶水∶尿素（80∶20∶0.5，v/v/w）、10号展层剂即无水乙醇∶冰乙酸∶水（50∶1∶10，v/v/v）均能够替代13号展层剂水饱和苯酚溶液用于分离氨基酸，但3号展层剂替代效果优于10号展层剂。