PLCε基因敲除小鼠微卫星DNA遗传监测分析

崔 智，李晓娟，白云峰，侯 俊，戴广海，李瑞生

(1.解放军总医院肿瘤综合治疗科，北京 100853；2.解放军第302医院实验技术保障中心，北京 100039)

随着生命科学的不断发展，越来越多的模型动物被广泛地应用于临床实验研究中。2001年 Song C等［1］在哺乳动物中克隆出与 PLC210同源序列的PLC，由于与其他已知的PLC不同，因而被命名为PLCε，2003年采用基因打靶法成功建立了 PLCε基因敲除小鼠。该模型小鼠其繁殖后代中有敲基因型、杂合型和野生型等三种混合类型，但从外观表型上很难鉴别其各自不同的基因类型。微卫星DNA标记技术是采用多态性微卫星DNA位点来对遗传物质DNA直接进行监测，以分析其遗传特性，该技术在大小鼠遗传监测中得到了广泛应用，并验证了它的准确性和可靠性［2］。因此，本研究应用所筛选的13个具有高度多态性的微卫星DNA位点和2个通过敲除基因序列自行设计的引物，对PLCε基因敲除小鼠群体的遗传背景进行有效地遗传质量监测，旨在分析其遗传背景特性和鉴别所生产繁殖的三种(敲基因型、杂合型和野生型)不同基因类型小鼠，为今后进行模型动物的研究和开发利用提供可靠的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

PLCε基因敲除小鼠来源于日本神户大学，由解放军第302医院动物实验中心生产繁殖，随机选取6～8周龄小鼠28只，雌雄各半，编号1～14号为雌性，15～28号为雄性，单鼠体质量为20g～25g，动物实验室饲养条件为SPF级，实验动物使用许可证号：SYXK(军)-2007-010。剪小鼠尾巴，-20℃冰箱内保存。

1.2 药品与生化试剂

硝酸银、冰醋酸、三羟甲基胺基甲烷、过硫酸铵、无水碳酸钠、甲醛、无水乙醇，DNA提取缓冲液，Taq DNA聚合酶和10×buffer(宝生物公司)，dNTP (Sangon公司)，TEMED(Sigma公司)。

1.3 引物合成

选择具有高度多态性的微卫星 DNA位点：D1Mit365、D3Mit51、D4Mit235、D6Mit102、D7Mit281、D8Mit113、 D9Mit23、 D10Mit180、 D13Mit88、D16Mit145、D17Mit36、D18Mit94、D19Mit97、Dq(敲基因型)和Dy(野生型)等15个微卫星基因座位点，这些位点引物序列均来自参考文献［3，4］，由上海生物工程技术有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 基因组DNA的提取：将28只小鼠尾巴各剪取1cm左右，剪细碎后放于2.0m L EP管内，加入30μL～35μL蛋白K及470μL DNA提取缓冲液，将其上下颠倒充分混匀后，置于 37℃水浴锅内过夜，待其全部消化溶解后，用等体积的Tris饱和酚和三氯甲烷分3次进行抽提DNA，用冰无水乙醇析出基因组DNA，干燥后用(50～200)μL TE全部溶解，然后用紫外分光光度计测其样品的纯度和浓度，配制成100ng/uL左右，置于4℃保存备用。

1.4.2 PCR的扩增：每个PCR扩增体系为50μL，缓冲液 buffer 5μL，上下游引物各 0.2μmol/L，dNTP 200μmol/L，Taq酶1U，DNA模板为1μL。反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，48℃ ～65℃退火30s，72℃延伸1min，循环25～30次，最后一个循环延伸 7 min，扩增产物于 4℃冰箱内保存。

1.4.3 电泳与银染检测；抽取已加入染料的PCR扩增产物10μL，注入8%聚丙烯酰胺凝胶样品孔中，200V电泳1h～2h。电泳后的凝胶用10%冰醋酸固定，硝酸银染色，碳酸钠显色，待条带清晰后，用终止液停显。然后进行图带拍照保存分析。

1.4.4 结果判读与分析：根据电泳后聚丙烯酰胺凝胶上的DNA图带，其泳动距离远近进行判读，按泳动距离远近设定为阿拉伯字母1、2、3……N，如果DNA图带泳动距离一致，可判定为单态性，若有差异可判定为多态性［5］。对于 Dq和 Dy两个位点的电泳图带，如果只有Dy位点有图带，而Dq位点没有图带，可判定为野生型；如果Dq和Dy两位点都有扩增图带，可判定为杂合型；若只有Dq位点有图带，而Dy位点没有扩增图带，则可判定为敲基因型。

2 结果

2.1 15个微卫星DNA位点PCR扩增条件分析

利用1号小鼠DNA对所筛选的15个微卫星DNA位点的各种浓度梯度条件进行了PCR扩增，通过对凝胶电泳图带的清晰程度、泳动距离进行了对比分析，获得各个微卫星DNA位点最佳Mg2+浓度、退火温度、扩增片段大小和扩增循环次数等扩增条件(表1)。

表1 15个微卫星DNA位点最佳PCR扩增条件Tab.1 The best conditions of PCR amplification of 15microsatellite DNA loci

图1 D3Mit51位点扩增的DNA图谱注：M：为marker，1-14：为1号-14号小鼠个体Fig.1 DNA mapping of amp lification of D3M it51locusNote：M：Marker；1-14：For 1-14individuals of mice

2.2 13个多态性微卫星DNA位点PCR扩增结果的分析

利用所获得的13个多态性微卫星DNA位点的最佳PCR扩增条件对28只小鼠分别进行了扩增，结果每个微卫星DNA位点的28只小鼠所扩增出来的图带其泳动距离一致，均呈单态性，其中D3Mit51位点单态性的扩增图谱结果(图1)。说明了此小鼠遗传背景呈现一致性，没有发生遗传变异，保持了遗传的稳定性。

2.3 Dq和Dy两个位点三种基因型的鉴别分析

利用Dq和Dy两个位点对28只小鼠进行了PCR扩增，其电泳图带结果发现4，6，11，16，19和23号小鼠的Dq位点有图带，而Dy位点没有图带，则可判定为敲基因型；5，9，14，17，21，22和28号小鼠的Dy位点有图带，而Dq位点没有图带，则可判定为野生型；而1，2，3，7，8，10，12，13，15，18，20，24，25，26和27号小鼠的Dq和 Dy两位点都有扩增图带，则可判定为杂合型。其中1-8号小鼠Dy和Dq两位点的PCR扩增图带(图2和图3)。

图2 Dy位点扩增的DNA图谱注：M：为Marker，1-8：为1-8号小鼠个体Fig.2 DNA mapping of amplification of Dy locusNote：M：Marker；1-8：For individuals 1-8of mice

3 讨论

小鼠微卫星基因座位点存在于整个基因组中，其核心序列为2～6bp的串联重复序列，重复次数达几次甚至几十次，由于其重复次数的不同而呈现出微卫星DNA位点的高度多态性。正是利用此特点可以对近交系、封闭群、杂合群及不同品系动物的遗传背景进行有效地监测分析，目前在小鼠基因图谱中包含了7 377个微卫星DNA位点，其中有6580个显示多态性［6］。本实验所选取的敲基因小鼠是来源于日本神户大学实验室［7］，由302医院动物实验中心保种繁殖，没有引入外来血缘。人们采用基因敲除技术已建立了许多人类疾病动物模型，如敲基因小鼠模型［8］、膀胱癌动物模型［9］、皮肤癌动物模型［10］、前列腺癌动物模型［11］等，但这些敲基因动物模型的遗传背景是否发生了改变，以及变异的程度还不是很清楚。因此，本实验利用所筛选的13个多态性高的微卫星DNA位点对所选取的28只成年小鼠进行了遗传背景的质量监测，结果显示13位点均呈现一条图带且泳动距离一致，说明该位点纯合且呈单态性，从而说明了该群体的遗传背景均一，没有发生遗传污染或遗传变异，符合实验动物近交系的基本要求。因此，应用微卫星DNA标记技术可以进行纯合位点的判定，同时也能对位点的变异情况进行分析，适于近交系动物的遗传质量检测［12］。这些高度多态性的微卫星DNA位点曾在不同品系大小鼠的遗传质量监测中得到过有效验证［13，14］。

图3 Dq位点扩增的DNA图谱注：M：为Marker，1-8：为1-8号小鼠个体Fig.3 DNA mapping of amplification of D3Mit51locusNote：M：Marker；1-8：For individuals 1-8of mice

该群体小鼠是严格按照杂合型自交方式来进行繁殖，按照孟德尔遗传学繁殖规律所产生的繁殖后代均会出现三种不同的基因型［15］，但从外观上很难鉴别。因此，本实验利用2个特殊位点对所选取的28只成年小鼠进行了遗传背景分析，鉴别出敲基因型小鼠6只，野生型小鼠7只和杂合型小鼠15只，该方法可以有效地鉴别出三种不同基因型小鼠，为今后该小鼠的应用和实验研究提供了可靠的保障［16］。

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