紫外分光光度法在制霉菌素油中制霉素含量测定中的应用

李丽萍，张杜娟，崔秀君

(济南市妇幼保健院，济南250001)

制霉素为抗真菌类药，能与真菌细胞膜上的特异甾醇结合，使细胞膜破坏，通透性改变，内容物外漏而致细胞死亡，用于治疗皮肤、黏膜等念珠菌感染［1］。制霉菌素油是本院自制外用制剂，由制霉素和甘油混合而成。本实验采用紫外分光光度法测定制霉素含量，用于制霉菌素油的质量控制。

1 仪器与药品

1.1 仪器 UV-2102PCS型紫外分光光度仪(上海龙尼柯仪器有限公司)，AL104电子天平(瑞士梅特勒—托利多)。

1.2 药品 制霉素标准品(批号130344-201002，5 341 U/mg，中国食品药品检定研究院)，制霉菌素油(鲁药制 ZBH0212，8.7 g/L，批号 20120808，20120814，20120817，济南市妇幼保健院)，制霉素原料(批号110908，5 000 U/mg，浙江震元制药有限公司)，甘油(批号20120118，湖南尔康制药股份有限公司)，甲醇(分析纯，批号T20061214，国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 制霉菌素油样品制备 取制霉素原料8.7 g，研细，加甘油适量，充分研匀，加甘油至1 000 mL即得。

2.2 溶液配制

2.1.1 储备液配制 精密称取制霉素标准品12 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，混匀，得120 μg/mL制霉素标准储备液，于4℃冰箱储存。

2.1.2 样品溶液配制 取制霉菌素油样品，摇匀，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇洗涤吸管内壁3次，洗液并入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀;精密量取稀释液2 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得制霉菌素油样品溶液。

2.3 波长选择 分别取制霉素标准溶液(12 μg/ mL)、制霉菌素油样品溶液，以甲醇为基线，以甘油加甲醇稀释为空白基质，采用紫外分光光度法，在200～400 nm波长范围内扫描。紫外吸收图谱(图1)显示，空白基质基本无吸收，制霉素标准溶液、制霉菌素油样品溶液的紫外吸收光谱一致，有3个吸收峰，分别为290、304、318 nm，在304 nm波长处吸光度最大，故选择304 nm为检测波长。

图1 不同溶液的紫外吸收图谱注:A:甲醇(基线);B:空白基质;C:制霉素标准溶液(12 μg/mL);D:制霉菌素油样品溶液

2.4 线性关系观察 分别精密量取制霉素标准储备液1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，得7.2、9.6、12.0、14.4、16.8 μg/ mL制霉素系列标准溶液。以甲醇为空白，在304 nm波长处测定吸光度值，以吸光度值对浓度(C)进行线性回归，在浓度7.2～16.8 μg/mL范围内，回归方程为吸光度 =0.009 80+0.047 25C，r= 0.999 6(n=5)，表明线性关系良好。

2.5 精密度 分别精密量取制霉素标准储备液适量，用甲醇稀释至高(14.4 μg/mL)、中(12.0 μg/ mL)、低(9.6 μg/mL)3个浓度，测定日内精密度。连续测定3 d，测得日间精密度，结果见表1。由表1数据可知，制霉素测定方法精密度良好。

2.6 重复性与中间精密度 ①重复性:精密量取同一批号的制霉菌素油6份，各1 mL，分别加甲醇稀释定容至50 mL;取稀释液2 mL，加甲醇稀释至25 mL，测定吸光度，计算含量及RSD值。结果见表2。由表2数据可知，该方法重复性良好。②中间精密度:不同分析人员、不同日期分别精密量取同一批号的制霉菌素油6份，各1 mL，用甲醇稀释(方法同重复性试验)，测定吸光度，计算含量及RSD值，结果见表3。由表3数据可知，该方法中间精密度良好。

表1 制霉素含量测定日内与日间精密度

2.7 加样回收率 分别精密称取制霉素标准品，加适量甘油，混匀，按处方比例分别配制高(120%)、中(100%)、低(80%)分别为6.96、8.70、10.44 mg/ mL的制霉菌素油样品，每个浓度各3份。分别用甲醇稀释625倍，分别得11.136、13.920、16.704 μg/ mL的制霉素标准溶液，测定吸光度，计算含量及RSD值。结果见表4。由表4数据可知，该方法回收率在98%～102%，符合测定要求。

2.8 稳定性 取制霉菌素油样品溶液和制霉素标准溶液(12 μg/mL)各3份，分别于室温避光放置2、4、8、12 h后，测定吸光度，并计算含量，考察制霉素

表2 制霉素含量测定重复性

表3 制霉素含量测定中间精密度

表4 制霉素含量测定加样回收率

室温避光放置稳定性。结果见表5。由表5数据可知，制霉菌素油样品溶液和制霉素标准溶液室温避光放置12 h稳定。

表5 制霉素含量测定稳定性

2.9 样品测定 精密称取制霉素标准储备液适量，加甲醇稀释，配制成12 μg/mL制霉素标准溶液。取3个批次制霉菌素油样品各1 mL，按2.1.2方法分别配制成制霉菌素油样品溶液，每个批次各3份。以甲醇为空白，分别测定制霉素标准溶液和样品溶液在304 nm波长处的吸光度，用对照法计算含量，结果见表6。结果表明，制霉菌素油含量在90%～110%，符合要求。

3 讨论

3.1 含量测定方法的选择 制霉素中主要包括制霉菌素A1、A3和多真菌素B［2］。根据国家药品标准WS1-C2-0025-89，制霉素含量测定采用抗生素微生物检定法，但该方法耗时、烦琐、整个实验过程中影响因素多，且采用的啤酒酵母菌的抑菌圈边缘清晰度不高，影响测定;刘兴兰等［3］等采用比浊法，该方法较管碟法简便，但影响因素较多;林艳等［4］采用高效液相色谱法测定制霉素的含量，用3个主峰的面积进行定量，因制霉素包含多种组分，此方法不够准确;文献多采用紫外分光光度法［5～10］测定制霉素的含量，该方法简便、快速和定量准确。本实验也采用紫外分光光度法，经验证，该法线性关系良好，精密度、重复性、稳定性均符合要求，可用于制霉菌素油的质量控制。

表6 样品含量测定结果(n=3)

3.2 溶剂选择 制霉素在甲醇中微溶，在水中极微溶解，在氯仿、乙醚中不溶，所以本实验采用甲醇作溶剂。

3.3 操作注意事项 制霉素具有引湿性，对光、空气、酸或碱均不稳定，制霉菌素油样品在长期放置后，颜色变深，所以本实验在操作过程中应注意避光，并缩短操作时间。制霉菌素油黏稠度较大，在吸取样品时，吸管内壁易残存样品溶液，使取样量误差较大，须用甲醇洗涤，以降低误差。

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