连翘酯苷对拟AD动物模型学习记忆的改善作用

李长禄，王红梅，王立为

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193)

随着人们生活水平的提高，人均寿命随之增加，全球人口趋于老龄化，阿尔茨海默病(AD)的发病率逐年上升，已成为威胁人们晚年健康的一大隐患。迄今为止，AD患者依然缺乏有效的治疗药物，目前的药物大部分只对AD的某一环节有阻断作用，并不能阻断AD发病的病程，所以这些药物能够改善AD早、中期的症状，但对AD晚期疗效较差。因此，寻找能够阻断AD病程发展的多靶点药物具有更重要的意义。天然药物作用靶点多且毒性低，所以中药或中药提取物已经成为当前研究AD治疗药物的热点。AD的发病机制复杂，主要有如下几种假说:胆碱能假说、氧化应激假说、炎症免疫假说、淀粉样蛋白假说、基因突变假说等。目前药物的研究主要集中在氧自由基、炎症因子及中枢神经元凋亡三个方面。连翘为木犀科植物的干燥果实，具有清热解毒、消肿散结之功效。连翘酯苷为其主要活性成分，具有抗菌、抗炎及体外抗氧化等药理作用。我们于2011年7～9月进行本实验，旨在通过检测动物行为学变化及生化指标的改变，来评价连翘酯苷用于治疗AD的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12月龄SPF级昆明(KM)雄性小鼠60只，2月龄SPF级KM雄性小鼠10只，由中国医学科学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK (京)2009-0007。药用植物研究所SPF动物房中饲养，实验室温度22～25℃，明暗周期12 h/12 h。

1.2 药物与试剂 连翘酯苷:由中国医学科学院药用植物研究所化学室制备;安理申:卫材(中国)药业有限公司制造，批号090807A;人参皂苷Rg1:上海融禾医药科技有限公司，批号100329;β-淀粉样蛋白(25-35)(Aβ25-35):Sigma产品，批号108K4794;乙酰胆碱酯酶(AchE)、乙酰胆碱转移酶(ChAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、单胺氧化酶(MAO)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器 小鼠自主活动仪及Morris水迷宫实时在线检测分析处理系统由中国医学科学院药用植物研究所、中国航天员科研训练中心、北京三维拓盟数字影像技术有限公司联合研制开发。

1.4 方法

1.4.1 Aβ25-35的配制与老化 将1 mg Aβ25-35用生理盐水配制成2 mg/mL的母液，置37℃ CO2恒温箱孵育4 d，使其变为聚集态的Aβ25-35［1］。

1.4.2 动物分组与给药 10只2月龄小鼠为青年对照组，60只12月龄小鼠随机分为6组，即老年对照组、模型组、连翘酯苷低剂量组(50 mg/kg)、连翘酯苷高剂量组(200 mg/kg)、安理申组(3 mg/kg)及人参皂苷Rg1组(10 mg/kg)，以上各组按相应剂量的药物灌胃，青年对照组、老年对照组和模型组小鼠以相同方法灌胃蒸馏水，1次/d，连续5周。

1.4.3 AD动物模型的建立［2］灌胃第21天时，除青年对照组和老年对照组外各组小鼠分别于腹腔注射0.8%戊巴比妥钠0.1 mL/10 g，待其麻醉后，右侧侧脑室(前囟后2 mm，旁开1.5 mm，深度2.5 mm)注射Aβ25-356 μg。

1.4.4 自主活动 自主活动计算机实时在线检测分析处理系统主要用于观察药物对小鼠是否有兴奋或抑制等影响。侧脑室注射10 d后将小鼠放入自主活动测试箱，适应5 min，测试10 min，计算机自动记录动物的运动总路程、运动总时间、平均运动速度。

1.4.5 Morris水迷宫实验［3］灌胃给药32 d后进行水迷宫实验，连续6 d。定位航行实验:灌胃给药1 h后将动物面向池壁置于水池内进行实验，历时5 d，1次/d，每次120 s，记录动物逃避潜伏期和游出率。空间探索实验:定位航行实验后将平台撤去，从目标象限的对角象限将动物面向池壁置于池内，使动物在池内游泳120 s，记录动物穿台次数。

1.4.6 脑组织生化指标检测 待水迷宫测试结束后将小鼠处死，迅速分离海马和皮层，液氮速冻。检测时将皮层超声匀浆制成10%的脑组织匀浆液，4℃以3 000 r/min离心10 min，取上清，按试剂盒说明测定SOD、AchE、ChAT、MAO活力以及MDA含量。

1.4.7 统计学方法 使用SPSS13.0统计软件进行分析，实验结果以±s表示，进行多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间差异采用LSD(方差齐)或者Games-Howell法(方差不齐)，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自主活动测试结果 见表1。

表1 连翘酯苷对Aβ25-35导致的学习记忆障碍小鼠自主活动的影响(±s，n=10)

表1 连翘酯苷对Aβ25-35导致的学习记忆障碍小鼠自主活动的影响(±s，n=10)

组别 平均速度(cm/s)运动总时间(s)静息总时间(s) 1.86±0.22 139.72±12.85 760.13±12.85老年对照组 2.09±0.30 156.22±19.46 743.65±19.74模型组 1.72±0.36 134.64±24.69 765.22±24.68安理申组 1.25±0.22 99.89±15.12 799.99±15.12人参皂苷Rg1组 1.50±0.32 118.34±18.94 781.53±18.94连翘酯苷高剂量组 1.71±0.31 134.22±21.90 765.65±21.90连翘酯苷低剂量组青年对照组1.65±0.25 128.54±15.98 771.33±15.99

2.2 Morris水迷宫实验结果 定位航行实验结果见表2、3。而在探索实验中，青年对照组、老年对照组、模型组、安理申组、人参皂苷Rg1组、连翘酯苷高剂量组、连翘酯苷低剂量组穿台次数分别为(0.94±0.14)、(0.72±0.14)、(0.50±0.13)、(0.61±0.13)、(0.50±0.75)、(1.00±0.18)、(1.04±0.22)次。与青年对照组比较，模型组小鼠在目标象限穿台次数减少(P＜0.05)。长期给予小鼠连翘酯苷可明显增加小鼠穿台次数(P＜0.05)，改善小鼠空间探索能力;而安理申和人参皂苷Rg1的穿台次数与模型组比较并未出现显著性差异。

表2 连翘酯苷对Aβ25-35导致的学习记忆障碍小鼠游出率的影响(±s，n=10)

表2 连翘酯苷对Aβ25-35导致的学习记忆障碍小鼠游出率的影响(±s，n=10)

注:与青年对照组比较，#P＜0.05;与模型组比较，*P＜0.05

组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年对照组 0.50±0.19 0.63±0.18 0.38±0.18 0.78±0.15 0.88±0.13老年对照组 0.13±0.13 0.50±0.19 0.63±0.18 0.88±0.13* 0.88±0.13*模型组 0.00±0.00# 0.14±0.14 0.57±0.20 0.43±0.20 0.43±0.20#安理申组 0.50±0.22* 0.83±0.17* 0.50±0.22 0.83±0.17 0.83±0.17人参皂苷Rg1组 0.43±0.20 0.57±0.20 0.43±0.20 0.71±0.18 1.00±0.00*连翘酯苷高剂量组 0.14±0.14 0.43±0.20 0.75±0.16 1.00±0.00* 0.86±0.14*连翘酯苷低剂量组 0.33±0.21 0.17±0.17 0.83±0.17 0.83±0.17 1.00±0.00*

表3 连翘酯苷对Aβ25-35导致的学习记忆障碍小鼠潜伏期的影响(s，±s，n=10)

表3 连翘酯苷对Aβ25-35导致的学习记忆障碍小鼠潜伏期的影响(s，±s，n=10)

注:与青年对照组比较，#P＜0.05;与模型组比较，*P＜0.05

组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年对照组 94.00±13.88 65.79±17.48 74.27±18.42 24.03±7.33 20.23±7.60老年对照组 109.67±9.64 78.27±15.78 78.03±19.69 36.39±9.43* 36.94±11.48*模型组 119.29±0.11 106.92±12.35# 109.10±10.13 98.75±13.26# 90.12±18.43#安理申组 85.47±15.68* 69.52±11.76 75.86±24.48 41.44±11.75* 49.94±19.64人参皂苷Rg1组 99.90±11.32 89.87±14.27 84.87±18.08 48.34±18.33* 39.85±11.45*连翘酯苷高剂量组 115.89±3.37 102.11±11.42 75.96±14.86 33.77±10.01* 34.11±5.47*连翘酯苷低剂量组 102.66±12.49 105.00±14.12 76.77±13.77 34.50±12.41* 38.02±15.64*

2.3 脑组织生化指标检测 见表4、5。

表4 脑组织海马AchE、ChAT、SOD活力检测结果(±s，n=10)

表4 脑组织海马AchE、ChAT、SOD活力检测结果(±s，n=10)

注:与青年对照组比较，#P＜0.05;与模型组比较，*P＜0.05

组别AchE (U/mg prot) ChAT (U/mg prot) SOD (U/mg prot) 4.06±0.29 128.19±5.73 115.37±10.24老年对照组 4.47±0.34 81.09±12.08# 111.96±4.29模型组 5.69±0.56# 73.60±11.27# 97.46±3.83#安理申组 4.69±0.10 87.56±22.15 112.85±5.20人参皂苷Rg1组 5.24±0.42 107.33±20.12 135.52±4.25*连翘酯苷高剂量组 4.01±0.40* 128.64±12.88* 119.42±6.01*连翘酯苷低剂量组 4.90±0.27 108.10±10.42* 117.51±5.45青年对照组*

3 讨论

AD由巴伐利亚的神经病理学家Alois Alzheimer 1907年首先发现。AD是一种神经系统退行性疾病，在临床上主要表现为进行性记忆力减退和智力下降。病理特征主要以老年斑、神经细胞内的神经纤维缠结、淀粉样蛋白(Aβ)沉积以及神经元空泡变性和大量丧失为主。

Aβ级联假说认为Aβ在脑内沉积是AD的一个主要病理特征，现已公认Aβ是引起AD的主要因素，使用Aβ来造成AD的模型成为理想的研究AD的途径［4］，在AD药物筛选中应用广泛。本课题选用右侧侧脑室注射Aβ25-35建立拟AD动物模型，其优点是可以模拟AD的学习记忆障碍、炎症反应和神经元损伤等行为学和病理学方面的特征。另外，刘克明等［5，6］报道，在行为学试验中，自然衰老小鼠(15月龄)水迷宫逃避潜伏期明显延长，说明其学习记忆能力减退，脑组织肾上腺素和组织多巴胺均降低。因此，相对于年轻小鼠脑室注射Aβ模型来说，本实验在衰老的基础上给予Aβ损伤模型更符合老年痴呆临床基础，在AD药物筛选中更具有说服力。

表5 脑组织皮层AchE、ChAT、SOD、MAO活力及MDA含量检测结果(±s，n=10)

表5 脑组织皮层AchE、ChAT、SOD、MAO活力及MDA含量检测结果(±s，n=10)

注:与青年对照组比较，#P＜0.05;与模型组比较，*P＜0.05

组别AchE (U/mg prot) ChAT (U/mg prot) SOD (U/mg prot) MAO (U/mg prot) MDA (U/mg prot)青年对照组 6.01±0.61 38.03±2.73 56.86±1.96 17.76±0.1913.87±2.15老年对照组 6.18±0.26 26.13±1.87# 46.72±1.06# 18.30±1.93 15.01±1.83模型组 8.00±0.49# 14.39±1.19# 49.53±1.16# 24.05±0.43# 26.26±2.26#安理申组 6.56±1.16 27.27±7.13* 54.46±1.63* 19.11±1.27* 17.81±2.07*人参皂苷Rg1组 5.30±0.34* 34.16±4.84* 48.86±3.14 23.81±0.64 14.80±1.24*连翘酯苷高剂量组 6.28±0.32* 30.07±3.23* 55.28±2.17* 16.64±0.56* 17.34±1.12*连翘酯苷低剂量组 7.39±0.49 24.34±1.63 51.86±0.47 17.36±2.54*21.94±0.53

从水迷宫实验结果来看，Aβ25-35侧脑室注射复合自然衰老模型小鼠游出率明显下降，逃避潜伏期明显延长，在空间探索实验中小鼠穿越原平台次数减少，小鼠的学习记忆能力明显下降，而没有接受Aβ25-35损伤的12月龄自然衰老小鼠学习记忆能力有所下降，但与2月龄年轻小鼠没有统计学差异。而连翘酯苷可明显提高模型组小鼠的游出率，缩短逃避潜伏期，增加穿台次数。从行为学的角度可以看出，连翘酯苷可以改善模型组小鼠的学习记忆能力。同时安理申和人参皂苷Rg1在水迷宫实验中也可不同程度的改善模型组小鼠的学习记忆能力。

衰老过程中，神经元细胞膜上的不饱和脂肪酸被氧化可产生大量自由基，引发链式脂质过氧化反应损伤细胞膜，进而使细胞凋亡。同时氧自由基造成的氧化应激能促进Tau蛋白的异常磷酸化，导致神经纤维缠结，进而促使AD的形成［7］。SOD是机体清除自由基的重要酶类，其作用主要是催化生物氧化产生超氧自由基，清除并阻止由氧自由基引发的自由基连锁反应。MDA是自由基对生物细胞膜损伤的主要代谢产物，能使生物膜变性、坏死，使DNA发生突变、交链，同时使SOD活性降低，而造成自由基连锁反应的恶性循环［8］。实验结果显示连翘酯苷可以显著地提高模型组小鼠脑组织海马、皮层中SOD的活性，同时降低模型组小鼠脑组织皮层中MDA的活性。提示连翘酯苷可以通过抑制氧自由基的形成，改善模型动物的学习记忆能力。同时安理申和人参皂苷Rg1也可以不同程度的改善这两个指标。

海马与大脑皮质投射的基底前区脑胆碱能系统神经元及突触的大量损伤、丧失是AD患者记忆、认知能力减退的主要原因。AchE和ChAT是反映中枢胆碱能系统代谢的一对特异性酶，两者活性直接影响脑内兴奋性递质乙酰胆碱(Ach)的含量［9］。实验结果显示连翘酯苷可以使模型组小鼠脑组织海马、皮层中ChAT的活性显著升高，同时显著地降低AchE的活性。从而改善了改善胆碱能系统，增加脑内Ach水平，从而提高胆碱能神经元的兴奋性，提高了学习记忆能力。同时安理申和人参皂苷Rg1也可以不同程度的改善这两个指标。

MAO是大脑周围神经组织中一种十分重要的酶，不仅能提高有害的H2O2的水平，而且是代谢多巴胺、去甲肾上腺素与肾上腺素等儿茶酚胺递质类的重要酶，可以使单胺类神经递质含量下降，促进神经系统的老化过程。所以MAO活性表达变化，也可在一定程度上反映中枢神经系统单胺能神经—儿茶酚胺类神经递质系统的功能状况。实验结果显示连翘酯苷和安理申可以显著地使模型组小鼠脑组织皮层中MAO的活力下降，提示连翘酯苷AD小鼠脑神经递质可能具有重要的保护作用。

综上所述，连翘酯苷对AD模型小鼠的学习记忆障碍具有改善作用，可能是连翘酯苷的抗氧化作用和调节神经递质代谢系统综合效应的结果。本实验为以后对连翘酯苷在抗老年痴呆新药研制中提供了依据。

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