盐酸美金刚对兔受损视神经的保护作用

胡丽荣，肖 倩，王景春，李金明，杨 峰，张爱军，王福海

(1河北联合大学附属医院，河北唐山063000;2唐山市丰润区人民医院)

目前，视神经损伤的治疗手段主要是早期大剂量应用糖皮质激素并行视神经管减压术。Mariak等［1］通过对视神经损伤患者3～11 a的临床随访观察后认为，经过上述两种方法的治疗并不能有效阻止视神经萎缩的发生。谷氨酸是神经系统主要的兴奋性神经递质，通过作用于其受体而发挥神经毒性作用。研究表明，谷氨酸兴奋毒性是视神经受压、挫伤、切断及缺血等导致的视网膜神经元损伤和死亡的主要机制之一［2］。从理论上讲，应用谷氨酸受体拮抗剂，可以减轻和预防视网膜神经元的损伤。盐酸美金刚是一种非竞争性谷氨酸受体拮抗剂，动物实验［3］证实，其对缺血缺氧性损伤视神经有保护作用。2011年6月18日～8月25日，我们通过制作兔视神经损伤模型，采用盐酸美金刚治疗，观察其视网膜谷氨酸浓度变化及视网膜病理形态学变化，探讨其对兔受损视神经的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康大白兔(由本院动物实验中心提供)，雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg，实验性饲养3 d后用于实验。

1.2 兔视神经损伤模型的制作 用1g/L的乌拉坦经兔耳缘静脉注射麻醉。剪开实验兔外眦5 mm，缝线开睑，于颞上方角膜缘处剪开球结膜，在上直肌、外直肌的止端做牵引缝线，将眼球牵向鼻下方，钝性向球后分离，暴露视神经，用中号显微血管夹(夹持力为98 g)在球后3 mm处夹持视神经20 s，制成视神经损伤模型［4］。经检查，眼球无明显突出，眼睑闭合完全，术眼瞳孔散大，直接光反射迟钝或消失，眼底检查无视网膜出血及血管阻塞者为成功的视神经损伤模型并纳入实验。妥布霉素冲洗术野，缝合球结膜及外眦，术眼滴氯霉素眼药水、涂红霉素眼药膏。

1.3 动物分组及给药方法 随机选择具备入选条件的健康大白兔18只作为对照组(A组)，不作任何处理。选造膜成功的兔子48只，随机分为损伤生理盐水组(B组)24只、损伤治疗组(C组)24只，B、C两组又随机分为B1组18只、B2组6只及C1组18只、C2组6只。B、C两组兔子双眼制作视神经损伤模型后，C组每日上午一次性给予盐酸美金刚灌胃，每日每只兔子10 mg(溶于5 mL生理盐水中);B组给予生理盐水5 mL灌胃，给药时间同C组。

1.4 视网膜谷氨酸检测及形态学观察 造模后第1、3、7、14、21、28天随机处死(击头处死)A组兔子3只、B1组3只、C1组3只，迅速摘取眼球(双眼)，去除眼前节，剥离视网膜并称重、匀浆，置入EP管，－80℃冰箱保存，用于检测视网膜谷氨酸浓度(用高效液相色谱法)。同样时间点，选取B2组兔子1只、C2组1只处死(击头处死)，在眼球颞侧标记，取双侧眼球后多聚甲醛固定，石蜡包埋，在视盘颞侧2～3 mm处制作视网膜切片，HE染色，光电显微镜下观察视网膜形态，用麦克奥迪数码分析系统摄取图像。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。数据比较用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组视网膜谷氨酸浓度比较 检测结果见表1。由表1可见，视神经损伤后视网膜谷氨酸浓度迅速增高，第3天达高峰后开始下降，第14天时仍较高，第21天后基本恢复至正常水平。与B1组相比，第1～4天C1组谷氨酸浓度明显降低。

2.2 各组视网膜形态学观察结果 B2组视网膜形态变化:伤后第1天，视网膜神经纤维层水肿，神经节细胞明显水肿，外形不规则;伤后第3天，神经节细胞部分空泡样变，内核层细胞水肿，排列稀疏;伤后第7天，神经节细胞数量明显减少，细胞外形皱缩，部分核固缩;伤后第14天，神经节细胞数量继续减少，残存细胞不规则，损伤严重;伤后第21天，神经节细胞数量损失严重，偶见残存的细胞(皱缩，核固缩);伤后第28天，与伤后第21天相似。C2组视网膜形态变化:伤后治疗第1天，神经纤维层水肿，神经节细胞轻度水肿，排列欠规则;伤后治疗第3天，神经节细胞轻度水肿，少数细胞空泡样变;伤后治疗第7天，可见神经节细胞数量减少，水肿好转，排列较规则;伤后治疗第14天，神经节细胞数量较第7天未见明显减少，细胞外形、排列规则;伤后治疗第21天，神经节细胞数量未见继续减少，可见少量外形皱缩、核固缩细胞;伤后治疗第28天，可见外形皱缩、核固缩的神经节细胞，大部分细胞外形、排列规则。

表1 不同时间点各组网膜谷氨酸浓度比较(μmol/g，±s)

表1 不同时间点各组网膜谷氨酸浓度比较(μmol/g，±s)

注:与A组相比，*P＜0.05;与B1组相比，△P＜0.05

组别 眼谷氨酸第1天 第3天 第7天 第14天 第21天 第28天A组 6 22.16±2.83 25.89±3.70 24.83±4.60 28.33±2.37 25.96±2.89 23.25±3.96 B1组 6 105.83±7.57* 138.95±5.52* 88.30±5.54* 48.36±5.07* 28.04±2.34 26.13±3.83 C1组 6 63.89±3.84＊△ 67.48±4.51＊△ 33.32±3.79＊△ 25.40±3.97△24.78±4.50 25.09±4.89

3 讨论

正常情况下，从突触释放的谷氨酸进入突触间隙后，大部分被神经末梢重新摄取再利用，也有部分被Müller细胞从突触间隙运走，为神经节细胞提供营养和保护［5］。Otori［6］发现，谷氨酸浓度升高会引起神经节细胞死亡，并呈剂量依赖性。陈橞桦等［7］经动物实验证明，兔眼部钝挫伤后，玻璃体内谷氨酸浓度升高，并且诱导视网膜神经节细胞的凋亡。我们在本实验中也发现，兔视神经损伤后其视网膜谷氨酸浓度迅速升高，第3天达高峰后开始下降，第14天时仍高于正常对照组;光镜下视网膜形态学观察可见，伤后第1天，视网膜神经纤维层水肿，神经节细胞明显水肿，第3天神经节细胞出现空泡样变性，从第7天开始神经节细胞数量明显减少，细胞外形皱缩，核固缩，至伤后第21天时，正常的神经节细胞数量损失严重，偶见残存的神经节细胞亦是形状不规则、核固缩，第28天较21天无明显变化。

谷氨酸通过作用于其受体而发挥神经毒性作用，目前已发现其受体有5个亚型，即NMDA、KA、AMPA、L-AP4、ACPD，后四种合称为非NMDA受体。NMDA受体与Ca2+通道偶联并与神经退行性疾病的关系更为密切［8］。本实验结果显示，兔视神经损伤后给予盐酸美金刚治疗，其视网膜谷氨酸浓度明显低于未治疗者;C组虽然在视神经损伤后第1天、第3天时可见神经节细胞水肿，排列欠规则，但明显轻于B组，从第7天开始，水肿已趋于好转，排列也变得规则，直到第21天时，可发现外形皱缩、核固缩的细胞，但大部分神经节细胞外形、排列规则。以上结果说明谷氨酸受体拮抗剂盐酸美金刚对受损的视神经有一定的保护作用。

盐酸美金刚是金刚烷胺的二甲级衍生物，是一种非竞争性的NMDA受体拮抗剂，美国食品与药物管理局于2004年10月批准将该药用于治疗帕金森病，加拿大于2004年10月批准将该药用于治疗阿尔茨海默病。在本实验中，每只兔子每日给予10 mg的盐酸美金刚顿服，兔饮食饮水正常，排尿排便正常，无狂躁迹象;兔眼结膜无明显充血，角膜透明，前房深浅正常，眼底未见出血等改变。因此，我们推测，每日10 mg剂量的盐酸美金刚是相对安全的。

［1］Mariak Z，Mariak Z，Obuchowska I，et al.Remote resuits of conservative treatment of traumatic neuropathy［J］.Neurol Neurochir Pol，1998，32(5):1165-1172.

［2］Vorwerk CK，Zurakowski D，McDermott LM，et al.Effects of axonal injury osszsn ganglion cell survival and glutamate homeostasis［J］.Brain Res Bull，2004，62(6):485-490.

［3］Gruden G，Setti G，Hayward A，et al.Mechanicai stretch induces monocyte chemoattractant activity via an NF-kB-dependentmonocyte chemoattractant proteirr-mediated pathway in human mesangial ceiis:inhibition by rosiglitazone［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16 (3):688-696.

［4］王丽，朱豫，李志刚.轻中重度视神经损伤动物模型制作和病理学评价［J］.眼科新进展，2009，29(10):739-744.

［5］Taylor S，Srinivasan B，Wordinger J，et al.Glutamate stimuiates neurotrophin expression in eultured Müller cell［J］.Brain Res Mol Brain Res，2003，111(1-2):189-197.

［6］Otori Y.Neurotoxic effects of low dose of glutam ate on purified rat retinal ganglion cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1998，39(6): 972-981.

［7］陈穗桦，王理理，黄振平.兔眼爆炸伤后玻璃体谷氨酸含量的改变及意义［J］.医学研究生学报，2002，15(2):127.

［8］Sucher NJ，Lipton SA，Dreyer EB.Molecular basis of glutamate toxicity in retinal ganglion cells［J］.Vision Res，1997，37(24): 3483-3493.