木犀草素对人胃癌HGC-27细胞迁移的影响及机制

王 鹏，姜战武，孙玉国，曲 杰

(1承德医学院，河北承德067000;2保定市第一中心医院;3承德医学院附属医院)

木犀草素是一种天然黄酮类化合物，多以糖苷的形式存在于多种植物中，以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高，具有镇咳和祛痰作用，临床上多用于止咳、祛痰、消炎、治疗心血管疾病、治疗炎症性脱髓鞘疾病、SARS、干燥性皮肤瘙痒等［1～5］。近年来对木犀草素抗肿瘤作用的研究主要是其抑制肿瘤的增殖与促进凋亡［6，7］，未见关于其抑制胃癌细胞迁移功能的报道。本研究旨在观察木犀草素对人胃癌细胞系HGC-27细胞体外迁移能力的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人胃癌HGC-27细胞由承德医学院附属医院中心实验室提供。

1.1.2 主要试剂及仪器 RPMI Medium1640培养基干粉和胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品，胰蛋白酶为Amersco公司产品，二甲基亚砜(DMSO)、Luteolin、MMP-7及β-actin抗体为Sigma公司产品，辣根过氧化物酶标记的二抗为北京中杉金桥公司产品。Lu溶解在DMSO中，浓度为100μmol/L，－20℃保存，实验中用相应的培养液或溶剂稀释。

1.1.3 仪器 Primo R型低温高速离心机(德国Heraeus公司)，CO2培养箱(美国Forma公司)，倒置荧光显微镜(Zeiss公司)，HFsafe-1500型生物安全柜(HEAL FORCE公司)，Transwell小皿(Millipore公司)，3633型高压消毒锅(美国Yamato scientificwc公司)，HP-8453紫外—可见分光光度计(惠普公司)，梅特勒—托利多AG245电子分析天平(瑞士梅特勒—托利多公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及培养 HGC-27细胞置37℃、5%CO2培养箱，用含10%FBS以及青、链霉素各100 U/mL的RPM1640培养液培养。倒置显微镜观察细胞生长情况，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞接种于6孔培养板，每孔容积1 mL，其中3孔分别加入10、20、40 μmol/L的木犀草素溶液100 μL，分别为A、B、C组，另外3孔加入等量DMSO作为对照(对照组)。常规培养。培养24 h后于倒置相差显微镜下直接观察培养板中肿瘤细胞形态特征。

1.2.2 细胞迁移能力检测 ①细胞划痕实验:将HGC-27细胞铺满6孔培养板，待细胞贴壁长满后进行划痕，PBS洗1遍，更换为无血清培养基，培养24 h。结果以培养24 h后HGC-27细胞覆盖区域占起始划痕面积的百分比表示。②Transwell实验:取指数生长期的HGC-27细胞，胰酶消化，RPM1640培养基制备细胞悬液，细胞计数。调整细胞数为每100 μL悬液含5×104个细胞进行铺板。24孔培养板中每孔加入600 μL含15%小牛血清的RPM1640完全培养基，在Transwell小室的上室分别加入100 μL HGC-27细胞悬液，各含5×104个细胞，最后上室加入10 μL的1%BSA，使BSA最终浓度为0.1%，以保持上室内的渗透压。加入不同浓度的木犀草素100 μL，37℃、5%CO2培养箱常规培养15 h。取出小室用90%乙醇固定，0.1%结晶紫溶液染色，置于显微镜下观察并拍照，随机选取4个低倍视野(× 400)进行细胞计数，并计算平均值。实验重复3次。结果以实验组HGC-27细胞穿膜数量占对照组细胞穿膜数量的百分比表示。

1.2.3 MMP-7水平检测 采用Western blot法。分别取木犀草素处理前后的HGC-27细胞均约5× 106个，加入300 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min后转移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min 4℃离心4 min，取上清液置于－20℃保存。BCA法测定蛋白浓度。每个泳道上样蛋白量为40 μg，上样于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)，80 V电泳30 min，120 V电泳90 min，电泳完毕后，将蛋白转移至PVDF膜，用新鲜配制的含5%脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液(PBST液)摇床上封闭2 h，加入MMP-7抗体(1∶500)及抗β-Actin抗体(1∶500)，4℃反应过夜。然后将膜取出，用PBS液洗涤3次，每次15 min，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000)室温封闭1 h，然后用PBST液洗涤3次，每次10 min，最后用化学发光法检测，X线片记录结果。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。数据用±s表示。多组间的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学变化 正常培养条件下生长的HGC-27细胞形态不规则，呈三角形或梭形，轮廓清晰，包膜完整，胞体透亮，贴壁良好。培养24 h后与对照组相比A组HGC-27细胞形态没有明显变化;B组HGC-27细胞开始皱缩，生长缓慢，体积变小，胞质浑浊，细胞周缘模糊，出现细胞间隙;C组HGC-27细胞间隙增大，体积缩小，胞质浓缩，细胞生长缓慢，胞体皱缩，部分细胞破碎，总体呈分散悬浮生长，贴壁现象减弱甚至消失。

2.2 细胞迁移能力 划痕实验中培养24 h后，未经木犀草素处理的HGC-27细胞运动迁移基本完全覆盖了划痕区域，而A、B、C组HGC-27细胞仅覆盖了96.2%、72.3%、55.6%的划痕区域。Transwell实验中A、B、C组HGC-27细胞穿膜数量占对照组细胞穿膜数量的百分比分别为97.6%、59.5%、20.0%。

2.3 MMP-7的表达情况 Western blot结果显示，经木犀草素处理过的HGC-27细胞中MMP-7表达较对照组明显降低，随着木犀草素浓度的增加而减少，见图1。

图1 木犀草素对人胃癌HGC-27细胞中MMP-7表达水平的影响

3 讨论

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。据2000年资料统计，全球每年新发胃癌87万例，占所有新发癌症病例的9%，仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌，居第4位，每年约有64万人因胃癌死亡，居癌症死因的第2位［8］。胃癌的转移仍然是外科手术治疗的瓶颈。临床研究统计表明［9］，约60%就诊的肿瘤患者就诊时已经发生了转移，80%的患者最终要发展到肿瘤晚期阶段，约8.6%的患者就诊时周围血中能查见癌细胞，76%患者在肿瘤复发、转移的2 a内死亡。

肿瘤的转移过程机制和复杂伴随着多种细胞因子的异常表达［10］。基质金属蛋白酶(MMPs)是研究比较多的一个。目前已知肿瘤的侵袭与转移是肿瘤发展过程中的重要步骤，也是导致患者死亡的主要原因。MMP-7又称基质溶解素，是金属蛋白酶家族中最小的成员，可表达于多种组织的病理和生理过程中。肿瘤细胞产生且能够活化其他MMPs成员如MMP-2、MMP-9等，还能灭活丝氨酸蛋白酶抑制剂［11］，因此推测MMP-7在肿瘤的转移中发挥直接作用。

我国是天然药物大国，应用中草药治疗肿瘤历史悠久，现代药理研究表明，木犀草具有抗肿瘤效果，可以通过抗增殖和诱导凋亡抑制恶性肿瘤细胞的生长，在体外对人非小细胞肺癌A549细胞、人子宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌CaCO2细胞、人胃腺癌AGS细胞、人胃癌MGC-803细胞、人肝癌HepG2细胞多种癌细胞有抑制增殖作用［12］，还可诱导一些癌细胞发生凋亡，在HeLa细胞和前列腺癌细胞系DU145等人类恶性肿瘤细胞中，木犀草素能显著上调死亡受体(DR5，也称为TRAILR2)，引起细胞凋亡，并伴随着Bcl-2-相互作用区域的剪切和Caspase-3、8、9、10的激活，而对正常细胞则没有类似作用［13］。王焕等［14］采用小鼠自发性肿瘤转移和被动转移模型，通过检测肿瘤转移结节数及脏器指数来研究木犀草素对小鼠Lewis肺癌和4T1乳腺癌转移的影响。结果显示木犀草素可有效抑制小鼠Lewis和4T1肺转移结节数，增强小鼠对癌症的相伴免疫反应，有明显的抗转移作用。

木犀草素对胃癌细胞迁移的研究国内未见报道。本研究结果显示木犀草素在10～40 μmol/L范围内对人胃癌细胞系HGC-27的增殖产生抑制作用，且呈浓度依赖性。40 μmol/L木犀草素作用24 h后对细胞增殖抑制率达到55.6%，表明木犀草素在体外能够有效的抑制胃癌细胞的增殖，Transwell实验表明木犀草素对人胃癌HGC-27细胞的迁移有明显的抑制作用，且其与用药浓度呈正向相关。同时，迁移能力减弱细胞中细胞因子MMP-7的表达被强烈抑制。据此，我们推测木犀草素抑制人胃癌HGC-27细胞的迁移与其抑制细胞内MMP-7的蛋白表达水平从而减少细胞外基质大分子蛋白水解有关。

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