核酸适体（aptamer）：一种具有潜力的肿瘤药物“靶向配基”

郝 兰 袁耿彪 王志刚

1.重庆医科大学超声影像学研究所，重庆 400010；2.重庆医科大学附属第二医院核医学科，重庆 400010

肿瘤的靶向疗法是利用特异性“靶向配基”的介导，将药物或其他杀伤肿瘤的物质选择性地运送到肿瘤部位、选择性地杀伤肿瘤细胞以提高治疗效果的一种治疗方法。近年来国内外核酸适体（aptamer）介导的主动靶向给药研究成为热点。核酸适体（aptamer）是经过一种新的体外筛选技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）， 从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合蛋白或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸，可以是RNA，也可以是DNA，长度一般为25～60个核苷酸[1]。SELEX技术自Tuerk等[2]1990年发明以来，在临床诊断、靶向药物研制方面得以广泛应用。首个核酸适配体药物“Macugen”[3]由美国FDA在2005年批准上市，成为核酸适配体领域的一个里程碑。美国Achemix、SomaLogic，德国Noxxon AG等多个公司正在开发核酸适配体药物和诊断试剂。肿瘤细胞靶向给药是提高肿瘤治疗效果减少毒副作用的有效途径。将药物偶联于肿瘤细胞特异性配体上是靶向给药的主要方法。核酸能特异性结合细胞并且随之内化，是理想的靶向细胞输送剂。核酸适体“靶向配基”介导或修饰的药物及药物纳米制剂，为主动靶向肿瘤细胞给药系统构建开拓了新方向。本文简要综述适体作为肿瘤药物“靶向配基”的应用研究。

1 核酸适体作为肿瘤药物“靶向配基”的优势

具有高特异性与亲和性“靶向配基”的筛选，是制约主动靶向给药系统研究的瓶颈[4-5]。以往修饰肿瘤药物的“靶向配基”是抗体、多肽和叶酸等分子，但这些配基修饰的靶向药物在实际应用中均存在着难以克服的缺陷。单克隆抗体潜在的免疫原性和制备的困难大大限制了其临床的应用和产业化的进程[4]；叶酸等小分子虽然有诸多优点，但要求病变组织细胞过多表达叶酸受体，靶向作用才得以实现[4-5]，而核酸适体却具有以下优点：

1.1 高亲合力、强特异性

随着体外高通量筛选技术SELEX的发展，筛选出的适体与配体间的亲合力很高。单链寡核苷酸只识别与其互补的空间结构，几乎可以完全避免非特异性结合。

1.2 靶标普适性

适体与靶标的识别不是碱基配对，而是与靶标在空间结构和构象的匹配，是主动靶向显像及主动靶向治疗的优选分子探针。

1.3 成本低廉、筛选制备技术成熟

目前细胞-SELEX技术成熟，适体筛选过程已实现自动化[6]；筛选出的适体通过化学合成，纯度高、准确性和重复性好。适体经适当的化学修饰[7]，稳定性提高，可在常温下长期保存及运输。

1.4 无免疫原性

适体在生物体系中不会引发免疫原性，在治疗中无毒性[8]。在“靶向配基”修饰方面更优于抗体等。

1.5 受体范围广泛

核酸适体结构的多样性导致其具有从小分子到蛋白质，甚至到细胞的受体[9-10]。

核酸不但是生物体基因信息的储存与传递的载体，而且也具有与蛋白类似的功能。越来越多的研究结果表明功能化核酸参与重要生命过程的调控。

2 核酸适体在药物“靶向配基”中的应用

2.1 核酸适体作为靶向药物

首先核酸适体作为抑制剂能抑制肿瘤生长过程中的相关靶蛋白。适体AS1411是首先进入临床研究的抑制癌症适体药物，它对肿瘤细胞的作用主要是调节核酶活性，损伤DNA，导致细胞凋亡。Laber等[11]进行了AS1411 又称为ARG001 临床用药剂量研究，实验表明从 1 mg/（kg·d）到 10 mg/（kg·d）晚期肿瘤患者都有治疗效果而且没有任何副作用。应用SELEX筛选技术，Chen等[12]成功得到针对人表皮生长因子受体-3（HER-3）的细胞外部分适体。研究指出其中的适体A30 可抑制MCF7 人乳腺癌细胞的生长。

2.2 核酸适体为“靶向配基”的Aptmer-siRNA药物

利用RNA干扰技术通过siRNA给药能特异性抑制致病基因的表达，尽管作为药物，siRNA在多种疾病治疗领域有些许研究进展[13]。但siRNA本身不具备对组织或细胞的靶向能力，靶向性仍然是影响该技术应用到临床治疗上的主要障碍[14]。将核酸适体作为“靶向配基”介导siRNA输送，能提高siRNA药物的靶向性。Mcnamara等[15]将核酸适体A10 与siRNA连接建立适配体介导的靶向输送siRNA药物，干扰PSMA阳性表达的前列腺肿瘤细胞LNCaP生存所需基因的表达，并且体外观察到，A10-siRNA结合体明显抑制肿瘤细胞的生长。Chu等[16]成功制备了适配子A9，适配子A9 较A10 具有更强的特异性识别前列腺癌变细胞表面抗原PSMA能力。将A9 适配体用生物素-亲和素方法偶联到siRNA链上，构建靶向复合体A9-siRNA，能特异性抑制PSMA阳性表达的前列腺肿瘤细胞LNCaP生长。研究同时指出A9-siRNA偶合体对基因表达抑制作用与A9-脂质体偶合体类似。

2.3 核酸适体为“靶向配基”的纳米粒

时下不同材料纳米粒因其诸多特点：可控释，易修饰，载药性及可工业化生产等，在靶向药物传递系统研究得到关注。Chen等[17]将巯基修饰的核酸适配子（aptmer）偶联到金纳米粒子（AuNPs）表面，制备出朊蛋白特异性的Apt-AuNPs纳米光学探针，并成功应用到细胞表面朊蛋白的光散射成像和电子透射显微成像分析，通过对Apt-AuNPs探针进入细胞的途径研究表明，窖蛋白核酸适配子介导的内吞作用可能是其进入细胞的一个重要途径。Lili等[18]所在课题组首次成功地用 （PAH/PSS）2 多层膜以及PAH-g-PEG-COOH修饰了BSA纳米粒子，并在粒子表面偶联适体AS1411，得到了同时具有靶向功能和pH响应包埋释放抗癌药物的纳米载体。细胞培养实验证明这种粒子对肝癌细胞靶向性明显，载药后对肝癌细胞毒性增强。将核酸适配体共价结合到纳米药物载体上可显著提升肿瘤靶细胞对纳米载体的吞噬，增强所载抗癌药在体外对肿瘤细胞的杀伤作用。

2.4 核酸适体为“靶向配基”的脂质体

脂质体作为药物载体是通过细胞的高渗透和高保留效应（enhanced permeability and retention，EPR effect）进行被动靶向。以核酸适体为靶向配基的脂质体药物主动靶向运输系统既克服了脂质体被动靶向的低选择性，同时提高了药物的疗效。Cao等[19]将核仁蛋白适体（nucleolin，NCL）偶联到顺铂脂质纳米囊上。用连接NCL-适体的顺铂脂质体制剂作用MCF-7 人乳腺癌细胞，存活率仅为40.5%，而未连接NCL-适体的顺铂脂质制剂作用MCF-7 细胞，存活率高达88.9%。“靶向配基”NCL-适体大大地提高了药物的化疗效果。Kang等[20]筛选得到了sgc8 适体，将适体与包裹了荧光素-右旋糖酐（FITC-Dextran，FD）的脂质体相连构成适体靶向脂质体，用其处理有sgc8 受体表达的CEM-CCRF细胞和无sgc8 受体表达的NB4 细胞共同培养，实验表明该适体靶向脂质体对白血病CEM-CCRF细胞具有高度选择性。

2.5 核酸适体为“靶向配基”的药物

核酸适体修饰药物是一种理想的靶向肿瘤药物制备策略。适体A10 能特异性靶向结合前列腺癌变细胞表面抗原（PSMA）。Bagalkot等[21]将多柔比星扁平的芳香环与核酸适体A10 三维构象中的短链结构通过非共价作用连接，得到了适体-多柔比星靶向药物。该适体-多柔比星靶向药物对PSMA有阳性表达的前列腺癌LNCaP细胞具有高度的特异靶向作用。Chu等[22]将细胞毒蛋白gelonin与anti-PSMA适体连接，发现其对PSMA阳性的LNCaP表达细胞的毒性比PSMA阴性的PC-3 细胞大600 多倍。

3 展望

由于核酸适体独有的特点，适体技术及其应用成为时下研究的热点，并在肿瘤的分子水平显像及应用于肿瘤靶向治疗（核酸适体做“靶向配基”），取得令人鼓舞的成果。国内谭蔚泓等[23]对适体的研究也赢得国内外关注。将适体技术嫁接到微纳米泡的靶向修饰中，有望实现分子水平的靶向显像与靶向治疗。总之，对核酸适体专家学者一致认为：①核酸适体是潜在靶向药物配基，同时能做干扰蛋白质靶标的靶向药物，在创新药物的研制方面具有很大的发展空间。②核酸适体与抗体相比免疫原性小；与基因治疗相比，它可以细胞外或膜蛋白作为靶标，避免必须输运到细胞内的问题。③核酸适体在体内的特异性有待验证，改变筛选条件提高适体特异性。

目前核酸适体的肿瘤医学应用国际上还在发展初期，挑战与机遇并存，期盼适体技术在肿瘤的诊断与靶向治疗方面发挥更大的作用。

[1] Ellington AD，Szostak JW.In vitro selection of RNA molecules that bind specific-ligands[J].Nature，1990，346（6287）：818-822.

[2] Tuerk C，Gold L.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase [J].Science，1990，249（4968）：505-510.

[3] Khati M.The future of aptamers in medicine[J].J Clin Pathol，2010，63（6）：480-487.

[4] Parker N，Turk MJ，Westrick E，et al.Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay[J].Anal Biochem，2005，338（2）：284-293.

[5] Yuan Y，Nymoen DA，Dong HP，et al.Expression of the folate receptor genes FOLR1 and FOLR3 differentiates ovarian carcinoma from breast carcinoma and malignant mesothelioma in serous effusions [J].Hum Pathol，2009，40（10）：1453-1460.

[6] Hybarger G，Bynum J，Williams RF，et al.A microfluidic SELEX p-prototype[J].Anal Bioanal Chem，2006，384（1）：191-198.

[7] Chelliserrykattil J，Ellington AD.Evolution of a T7RNA polymerase variant that transcribes 2-O-methyl RNA[J].Nat Biotechnology，2004，22：1155-1160.

[8] Lopesde WR，Coopusamy D，Morris L，et al.Cytotoxicological analysis of a gp120 binding aptamer with cross-clade human immunodeficiency virus type 1entryinhibition properties：Comparison to conventional antiretroviral[J].Antimicrobial Agents Chemotherapy，2009，53（7）：3056-3064.

[9] Mallikaratchy P，Tang Z，Meng L，et al.Aptamer directly evolved from live cells recognizes membrane bound immunoglob in heavy mu chain in Burkitt's lymphoma cells[J].Mol Cell Proteomics，2007，6（12）：2230-2238.

[10] Nery AA，Wrenger C，Ulrich H.Recognition of biomarkers and cellspecific molecular signatures：aptamers as capture agents[J].J Sep Sci，2009，32（10）：1523-1530.

[11]Laber DA，Sharma VR，Bhupalam L，et al.Update on the first phase 1 study of AGR100 in advanced cancer[J].J Clin Oncol，2005，23：3064.

[12] Chen CH，Chernis GA，Hoang VQ，et al.Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor recetor-3[J].Proc Acad Sci USA，2003，100（16）：9226-9231.

[13] Keller M.Nanomedicinal delivery approaches for therapeutic siRNA[J].Int J Pharm，2009，379（2）：210-211.

[14] Rowe W，Platt M，Day PJ.Advances and perspectives in aptamer arrays[J].Integr Biol：Camb，2009，1（1）：53-58.

[15] Mcnamara JO，Andrechek ER，Wang Y，et al.Cell type-specific deliveryofsiRNAswithaptamer-siRNAchimeras[J].NatBiotechnol，2006，24：1005-1015.

[16] Chu T，Twu KY，Ellington AD，et al.Aptamer mediated siRNA delivery[J].Nucleic Acids Res，2006，34（10）：e73.

[17] Chen LQ，Xiao SJ，Peng L，et al.Aptamer-conjugated gold nanoparticles as probes for imaging internalized pathways of prion protein[J].SCIENTIA SINICA：Chimica，2010，40（4）：393-398.

[18] Lili X，Weijun T，Dahai Y，et al.Bovine serum albumin nanoparticles modified with multilayers and aptamer for pH-responsive and targeted anti-cancer drug delivery[J].Journal of Materials Chemistry，2012，22：6053-6060.

[19] Cao Z，Tong R，Mishra A，et al.Reversible cell-specific drug delivery with aptamer-functionalized liposome s[J].Angew Chem Int Ed Engl，2009，48（35）：6494-6498.

[20] Kang H，O′Donoghue MB，Liu H，et al.A liposome-based nanostructure for aptamer directed delivery[J].Chem Commun：Camb，2010，46（2）：249-251.

[21] Bagalkot V，Farokhzad OC，Langer R，et al.An aptamer-doxorubicin physical conjugate as a novel targeted drug-delivery platform[J].Angew Chem Int Ed Engl，2006，45（48）：8149-8152.

[22] Chu TC，Mark JW，Lavery LA，et al.Aptamer：toxin conjugates that specifically target prostate tumor cells[J].Cancer Res，2006，66（12）：5982-599.

[23] Hui S，Xiaoxiao H，Weihong T.Activatable aptamer probe for contrastenhanced in vivo cancer imaging based on cell membrane protein-triggered conformation alteration[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2011，108（10）：3900-3905.