基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在病原真菌检验中的应用进展

张超 廖万清

(上海长征医院皮肤病与真菌病研究所 全军真菌病重点实验室 第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)

随着广谱抗生素、免疫抑制剂在临床的广泛使用，导管插管、腹膜透析、放射治疗等大量开展，尤其是人类免疫缺陷病毒 (HIV)感染者的不断增多，真菌病已成为影响人类生活质量、威胁生命健康的重要疾病之一。镜检和培养是临床实验室最常规的真菌检测方法，然而，镜检的阳性率较低，培养会受到时间及实验室人员技术水平的限制。分子生物学技术鉴定临床分离真菌方法多样，包括DNA中G+C mol%含量测定、核酸杂交技术、限制性酶切片段长度多态性分析、电泳核型分析、随机扩增多态性DNA分析、rDNA ITS序列分析等，不同方法之间各有优势和不足，仍在不断完善中［1］。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)是一种可用于检测大分子物质的“软电离”质谱分析技术。近年来，该技术在致病性微生物尤其是细菌的研究中被证实是一种准确、快速、经济的检验方法［2-4］。随着 MALDI-TOF MS技术的不断完善和发展，

其在致病性真菌研究中的作用也日显突出，现就该技术在病原真菌研究中的应用进展作一综述。

1 MALDI-TOF MS应用于微生物检验的基本原理

20世纪80年代后期，基质辅助激光解析电离(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI)和电喷雾电离 (Electrospray ionization，ESI)两种“软电离”技术在质谱领域的应用，开创了质谱技术研究生物大分子的局面［5-7］。MALDI-TOF MS的基本原理［8］:当用一定波长的激光照射由基质和样品形成的共结晶薄膜时，基质吸收激光能量而汽化，并迅速降解，样品解吸附，基质和样品间发生电荷转移从而使样品分子发生电离，样品离子在电场的作用下在飞行时间质量分析器 (time-of-flight analyzer，TOF)中加速飞行，根据到达检测器的飞行时间不同可计算不同离子的质荷比，从而对物质进行定性或定量的分析。由于基质的使用，样品不会因为过强的激光能量导致大分子物质被破坏，因此被称为“软电离”方式。

由于不同菌种或菌株的微生物表达的蛋白质不同，利用MALDI-TOF MS技术分析得到的质谱也是不同的，因此能够利用这些MALDI-TOF MS质谱“指纹”和与之前收集的数据库中的参考“指纹”图谱对比，从而鉴定包括细菌和真菌在内的各种微生物。

2 MALDI-TOF MS应用于真菌检验的现状

在致病性细菌研究方面，MALDI-TOF MS已在食源性致病菌、植物病原细菌、临床致病菌及其耐药性等方面进行了广泛研究［9］。MALDI-TOF MS对真菌进行检测的研究相对较晚，2000年，Welham 等［10］首次对 MALDI-TOF MS 技术在青霉、小柱孢菌和红色毛癣菌等真菌检测中的应用进行了初步研究。之后很多学者对MALDI-TOF MS在致病性酵母菌和丝状真菌检测中的准确性、检测条件以及应用范围等方面进行了更为深入的研究。

2.1 MALDI-TOF MS在酵母菌检测中的应用

Putignani［11］等对 303 株临床分离的酵母菌和酵母样菌进行MALDI-TOF MS检测，与传统方法鉴定符合率为84.8%，经基因分型校正后，鉴定准确率为91.7%，其中20株由于数据库数据缺乏而未得到鉴定。Seyfarth等［12］用MALDITOF MS与API ID 32 C系统两种方法检测83株酵母菌，二者准确率分别为94%和84.3%，而MALDI-TOF MS参考数据库的更新相比API要方便许多。2011年，McTaggart等［13］对 160株酵母菌，包括137株隐球菌和23株非隐球菌进行了MALDI-TOF MS检测，鉴定到种水平的准确率为100%，而新生隐球菌鉴定到亚种水平的准确度也高达85/86(98.8%)。2012年，Firacative等［14］利用 MALDI-TOF MS 技术对 164株新生隐球菌和格特隐球菌进行检测，能够100%准确鉴定到种，而且能够区分8个主要的分子类型 (新生隐球菌VNⅠ-VNⅣ，格特隐球菌VGⅠ-VGⅣ)。另外，他们还利用该技术成功鉴定出了四株新生隐球菌与格特隐球菌的种间杂交株。Pinto等［15］在没有向参考数据库中增加新菌株的情况下利用MALDI-TOF MS技术共检测了264株酵母菌。在对167株酵母菌的回顾性研究中，鉴定到属和种的准确率分别为96%和84%。在对67株酵母菌进行的前瞻性研究中，鉴定到种水平的菌株为53株 (79%)，准确度等同于形态学方法，而除了4株新生隐球菌没有得到准确鉴定外，其他菌株均准确鉴定到属的水平。在该项研究中，新生隐球菌的检测准确度很低，仅为1/6(17%)，这与McTaggart等［13］的研究结果相差较大，可能与该研究直接应用商品化数据库有关。张明新等［16］对60株临床分离的酵母菌研究时，用MALDI-TOF MS鉴定的结果与Vitek compact全自动微生物鉴定系统比对，鉴定符合率为95%(57/60)，他们认为质谱分析前准备阶段是鉴定的关键环节，其中培养条件和菌落处理溶剂是重要影响因素。

2.2 MALDI-TOF MS在丝状真菌检测中的应用

由于丝状真菌具有多种形态如菌丝、分生孢子等，使得蛋白质谱可能会因真菌的生长状况和样品部位的不同而发生变化，因此MALDI-TOF MS对丝状真菌的检测相对落后于细菌和酵母菌，但近年来亦有不少学者对此进行了从基础到临床应用方面的研究。

Alshawa等［17］对360株临床分离的皮肤癣菌和21株小柱孢属菌进行MALDI-TOF MS检测，鉴定到种的准确率分别为331/360(91.9%)和18/21(85.7%)，27株皮肤癣菌和3株小柱孢属菌没有得到鉴定是因为没有获得质谱信号，而只有2株 (0.5%)皮肤癣菌鉴定错误。同样是对黄曲霉和寄生曲霉进行MALDI-TOF MS检测，Hettick［18］和 Li［19］两位学者做出的质谱图虽然相似，但也有差别，Li的报告结果中m/z峰要比Hettick的少，这种差异可能是与Hettick对样品进行了微珠涡流法进行破壁处理有关。Hettick［20］还利用MALDI-TOF MS对青霉属进行了研究，他们对12种青霉进行了检测，结果全部鉴定到种的水平。他们的研究中得到的产黄青霉、橘青霉和扩展青霉三种青霉的质谱“指纹”图谱的峰值大都分布在 m/z 10 000 ～20 000，而Chen等［21］得到的峰值却分布于m/z 3 000附近，产生如此大差别可能是由于设备 (反射式TOF与线性TOF)、培养基、样品处理方式(全细胞与微珠涡流法)以及MALDI介质的不同所致，这也说明对MALDI-TOF MS进行真菌检测的方法学标准化十分必要。

Coulibaly［22］等对 MALDI-TOF MS 鉴定波氏假阿利什菌(尖端赛多孢子菌)的条件进行了研究。他们用22株标准株对培养基、培养时间以及蛋白提取方法的研究发现:培养基和蛋白提取方法对检测结果没有影响，沙氏培养基以及蚁酸即可用于培养菌株和蛋白提取;随着培养时间的延长，鉴定准确度会增高，但72 h已经足够鉴定出菌株。Marinach-Patrice［23］等对临床分离的 62 株镰刀菌进行了MALDI-TOF MS鉴定，其中57株 (92%)鉴定到种，4株由于数据库中缺少参考菌种没有得到鉴定。此外，通过对培养条件的研究，他们认为最佳的培养基为麦芽琼脂或者马铃薯葡萄糖琼脂培养基，最佳培养温度为27℃，最佳培养时间为72 h，传代培养在小于11次的情况下质谱不会发生改变。

Chierico［24］等对 20 种共 230 株丝状真菌进行了MALDI-TOF MS鉴定，他们分别对培养了48 h、72 h、96 h和120 h的菌落进行检测，准确率随着时间的延长而增加，为36.4%、50.0% 、77.3% 和 85.9%，培养 120 h是进行 MALDITOF MS鉴定比较理想的时间。Cassagne等［1］对丝状真菌的鉴定给出了标准化的检测程序。通过实验对比，他们最终选择沙氏培养基做菌落培养，培养时间为72 h，蚁酸作为真菌蛋白质提取 试 剂，α-氰 基-4-羟 基 肉 桂 酸 (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，α-CHCA)作为基质。利用该程序对属于33个菌种的177株丝状真菌进行鉴定，其中154株 (87%)得到准确鉴定;另外23株中，只有2株鉴定错误，21株是因为参考数据库中缺乏相应的菌种。如果进一步增加参考数据库的菌种种类，MALDI-TOF MS完全可以用于临床实验室的常规诊断。

3 MALDI-TOF MS应用于真菌检验的优势与不足

MALDI-TOF MS是一种准确、快速、高通量、成本相对较低的新型真菌检测方法。所测菌株需要培养3～7 d，每份样品制备大约需要20 min，而且能够一次性检测十几个菌株，而常规的形态学检测则通常至少需要1周。耗材和试剂的花费每份样品大约3.5元，尽管主要设备需要约140万元，但其运行成本较低，综合成本要相对传统鉴定方法低［13］。

目前MALDI-TOF MS存在的主要问题是数据库的不完善，数据库为公司所有，未能像核酸数据库BLAST那样免费面向公众。临床菌株的质谱和商品化的数据库中的质谱可能存在一定的差异，同一真菌在不同地区的分离株可能存在表型甚至基因结构的不同，因此不同国家和地区的实验室利用MALDI-TOF MS鉴定真菌时尚需同时参考根据本地区的菌株建立的数据库和商品化数据库。此外，MALDI-TOF MS还不能直接从体液以及其他组织中直接检测真菌的存在，进行质谱分析前分离培养仍是不可缺少的步骤［25］。另外，培养基、培养时间以及各种可能影响到检测结果的因素尚需标准化［26］。

4 展 望

MALDI-TOF MS是一种简单、快速、高通量、成本相对较低的有效检测技术。该方法是对传统微生物检测方法的补充，为真菌鉴定提供了新的选择。目前已经有学者着手建立针对微生物MALDI-TOF MS鉴定的免费网上质谱数据库［27］，相信随着网上质谱数据库的建立和不断完善，MALDI-TOF MS技术在真菌以及其他微生物检测等方面的应用将会更加广泛。

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