EGFR信号通路调控人胶质瘤U87细胞侵袭转移的分子机制

邢细红,曾 晖,王雄伟△,郭东生,汪 雷,万志先,李 焘,周红建

(三峡大学第一临床医学院:1.神经外科;2神经内科,湖北宜昌 443003;3.华中科技大学同济医学院附属同济医院,武汉 430030)

EGFR信号通路调控人胶质瘤U87细胞侵袭转移的分子机制

邢细红1#,曾 晖1,王雄伟1△,郭东生3,汪 雷1,万志先1,李 焘1,周红建1

(三峡大学第一临床医学院:1.神经外科;2神经内科,湖北宜昌 443003;3.华中科技大学同济医学院附属同济医院,武汉 430030)

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)信号通路与人胶质瘤细胞(U87细胞)增殖和侵袭转移的关系及调控分子机制｡方法 表皮生长因子(EGF,100ng/mL)､EGFR抑制剂——AG1478(10μmol/L)单独和联合处理U87细胞,采用MTT法和Transwell小室体外侵袭实验检测U87细胞增殖和体外侵袭能力;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)､MMP-9的表达水平;Western blot法检测磷酸化EGFR(P-EGFR)､磷酸化 AKT(P-AKT)蛋白表达｡结果EGF(100ng/mL)增加P-EGFR和P-AKT蛋白表达,使加药后24h和48h的细胞生长率分别提高了19.25%､22.32%(P0.05),使12h过膜细胞数由(27±4)个上升到(126±3)个(P0.05),促进 U87细胞的 MMP-2､MMP-9蛋白表达(P0.05);AG1478(10μmol/L)可以阻断EGF增加P-EGFR和P-AKT蛋白表达的作用(P0.05),并具有时间依赖性(P0.05),减弱 U87细胞体外侵袭能力(P0.05),抑制MMP-2､MMP-9蛋白的表达(P0.05)｡结论EGFR-PI3K/AKT信号通路参与调节U87细胞增殖和侵袭转移过程,其机制可能是EGFR-PI3K/AKT信号通路活化后,导致MMP-2和MMP-9蛋白的表达增加,对细胞外基质的破坏增强｡

神经胶质瘤;受体,表皮生长因子;基质金属蛋白酶类;肿瘤转移;肿瘤细胞,培养的

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在很多恶性肿瘤中出现突变､重排和过表达,并且与一些恶性肿瘤的预后密切相关,成为了恶性肿瘤治疗靶点｡研究发现EGFR在人胶质瘤中的过表达为64%,EGFR蛋白的表达与胶质瘤的恶性分化程度密切相关[1],而60%的多形性胶质母细胞瘤(GBM)中有EGFR基因的过表达[2]｡EGFR过表达与相应的配体结合后,通过不同的信号通路把细胞外信息传递到细胞内,作用相应的靶基因调控肿瘤细胞增殖､侵袭转移等细胞生物学行为｡胶质瘤的预后因素复杂,已证实EGFR参与胶质瘤细胞增殖侵袭的调控[3],但EGFR信号通路如何调控胶质瘤病情进展仍然不清楚,阐明其具体机制是改善胶质瘤治疗和预后的关键｡作者通过改变胶质瘤细胞(U87细胞)EGFR信号通路状态,研究EGFR信号通路与U87细胞增殖和侵袭转移的关系及其分子机制｡

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)､Tyrphostin AG1478､ECM gel､MTT和明胶均购于Sigma公司,胎牛血清和DMEM培养基购于Hyclone公司,Transwell(装有聚碳酸酯微孔膜,孔径8μm)购于美国Costar公司,磷酸化EGFR(P-EGFR)和磷酸化 AKT(P-AKT)兔抗人的单克隆抗体购于Santa Cruz公司;GAPDH小鼠抗人多克隆抗体､带HRP的抗小鼠和兔二抗､ECL显影液购于博士德公司,RIPA裂解液购于碧云天公司,X医用胶片购于Kodak公司｡

1.2 U87细胞的来源和培养 U87细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所,用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养进行实验｡

1.3 实验分组 实验分为对照组(不加任何药物)､实验1组(加EGF 100ng/mL)､实 验 2 组 (加 EGF 100ng/mL 和AG1478 10μmol/L),实验2组在AG1478作用1h后再加EGF｡

1.4 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的细胞以5×103个/孔接种于96孔板,待细胞培养24h后加药进行实验｡每组设4个复孔,继续培养24和48h,检测前4h每孔加MTT(5g/L)20μL和DMEM 180μL,4h后弃去上清液,加DMSO 150μL,避光震荡15min,用全自动酶标仪测490nm处的吸光度值[OD(490)]｡细胞生长率(%)=[OD(490)实验组-OD(490)空白]/[OD(490)对照组-OD(490)空白]×100%｡

1.5 Transwell体外侵袭实验 取对数生长期U87细胞用0.25%胰蛋白酶消化,培养液洗涤终止消化,900r/min离心5min,再用DMEM培养基悬浮细胞计数待用;低温条件下将100μL稀释后的ECM gel加入Transwell小室上室的PET膜上表面,37℃孵育4h使胶凝固｡每组设2个复孔,在Transwell小室下室加含10%FBS的DMEM培养基600μL,Transwell小室分别加DMEM培养基悬浮的细胞5×104个/孔,在37℃､5%CO2孵育箱中常规培养12h后,取出小室,用棉签擦掉小室的Matrigel基质胶和没有侵过的细胞,再用75%的乙醇固定20min,取出小室放入结晶紫中染色40min,400倍光镜下计5个视野细胞数,取均数｡

1.6 明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达 取对数生长期细胞胰酶消化后接种于6孔板,待细胞汇合度达90%,用PBS漂洗2次,用1mL PRIM 1640培养基培养24h,取上清2 000r/min离心5min,以去除细胞沉淀,取上清分装,冻于-80℃冰箱｡配置含0.1%明胶的10%SDS-PAGE凝胶,胶凝后配置5%上层胶｡BCA法测定收集的上清蛋白浓度｡取等量的蛋白,计算好体积,与2×loading buffer等比混合,室温放置10min,上样,冰水浴,100V恒压电泳3h,用含2.5%Triton X-100(V/V)的超纯水室温震荡洗凝胶2次,每次45min,中间换液｡将凝胶放入孵育液内37℃孵育42h｡凝胶置于含0.1%的考马斯亮蓝R-250染色液内(甲醇∶乙酸∶超纯水为4.5∶1.0∶4.5,V/V/V)震荡染色3h｡将凝胶置于脱色液(甲醇∶乙酸∶超纯水为4.5∶1.0∶4.5,V/V/V)脱色,直至能辨别蓝色背景下的 MMP-2(72×103)和 MMP-9(92×103)透亮条带｡用凝胶图像分析系统分析读取条带面积､宽度和灰度值｡

1.7 Western blot检测P-EGFR和P-AKT蛋白表达 RIPA裂解液裂解细胞后,行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至硝酸纤维膜上,用含5% 脱脂奶粉的TBST封闭1h,加一抗(P-EGFR､P-AKT和GAPDH 稀释倍数均为1∶1 000)4℃过夜｡TBST洗涤3次,每次10min,分别加兔抗小鼠与羊抗兔二抗(辣根过氧化物酶标记)室温孵育1h｡TBST洗涤3次,每次10min,ECL显色,X医用胶片摄影｡

1.8 图像分析 KODA凝胶成像系统照相,QUANTITY ONE分析软件(版本4.6)分析｡

1.9 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件,计量资料用±s表示,各组组间比较采用方差分析,生长率比较采用χ2检验,以P0.05为差异有统计学意义｡

2 结 果

2.1 EGF和AG1478对U87细胞P-EGFR和P-AKT蛋白表达的影响 外源性EGF(100ng/mL)作用U87细胞24h后PEGFR和P-AKT蛋白表达同时明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);而 AG1478(10μmol/L)能完全抑制外源性EGF的作用,使P-EGFR和P-AKT蛋白表达同时下降,与实验1组比较差异有统计学意义(P0.05)｡见图1､2｡

2.2 EGF和AG1478对U87细胞增殖的影响 EGF(100 ng/mL)作用U87细胞24h和48h后对细胞增殖具有促进作用,细胞生长率分别较对照组提高了19.25%､22.32%(P0.05),但没有时间依赖性(P0.05);AG1478(10μmol/L)能阻止EGF的促进细胞增长作用,明显抑制细胞生长,与实验1组比较差异有统计学意义(P0.05),而且有时间依赖性(P0.05)｡见图3｡

图1 Western blot电泳图片

图2 EGF和AG1478对U87细胞P-EGFR和P-AKT蛋白表达的影响

图3 EGF和AG1478对U87细胞增殖的影响

2.3 EGFR活性改变对U87细胞体外侵袭力的影响 细胞体外侵袭实验结果显示,体外侵袭力以侵入Transwell小室ECM凝胶PET滤膜的细胞数来判定｡对照组平均每个视野细胞数为(27±4)个,实验1组平均每个视野细胞数为(126±3)个,实验2组平均每个视野细胞数为(43±6)个｡实验1组与对照组相比侵袭力明显增加,差异有统计学意义(P0.05);实验2组与实验1组比较侵袭力明显降低,差异有统计学意义(P0.05),见插Ⅰ图4｡

2.4 EGF和AG1478对U87细胞 MMP-2和 MMP-9表达的影响 EGF(100ng/mL)作用24h后 MMP-2和 MMP-9蛋白的表达均较对照组增强(P0.05);而 AG1478(10μmol/L)可以抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达,与实验1组比较差异有统计学意义(P0.05)｡见图5｡

图5 明胶酶谱法凝胶图像

3 讨 论

EGFR是最早发现的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK),其蛋白结构分成胞外域､跨膜区与胞内域3部分｡EGFR 家族蛋白主要有 EGFR/ErbB-1､HER2/ErbB-2､HER3/ErbB-3和 HER4/ErbB-4 4类,分别由原癌基因c-erbB(1～4)编码,并通过可变剪切形成许多特殊受体蛋白产物[4]｡EGFR的扩增､过表达和突变在胶质瘤的发生和发展中起到重要作用,是恶性胶质瘤的责任基因之一｡董伦等[1]研究发现EGFR在人胶质瘤中的过表达为64%,EGFR蛋白的表达与胶质瘤的恶性分化程度密切相关,而40%～60%GBM中有EGFR基因的过表达[5]｡过度激活的EGFR可以通过Ras-MAP激酶途径､PI3K/Akt途径及STAT-3等3条信号转导途径把细胞外信号传到细胞内,并激活多种基因的异常表达而导致细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进细胞迁移､侵袭和促进血管生成等改变｡

研究发现EGF通过激活EGFR-PI3K/AKT信号通路促进前列腺癌细胞生长与增殖,同时提高侵袭能力,封闭EGFR基因后,EGF作用被抑制[6]｡国内有学者报道EGF激活结肠癌细胞的EGFR信号通路活化,促进 MMP-2和 MMP-9的过表达而增强结肠癌细胞的侵袭能力,这种作用可以被EGFR抑制剂 阻 断[7-8]｡ 席 桂 发 等[3]研 究 却 发 现 低 浓 度 EGF(100 ng/mL)可以促进胶质瘤GL-15细胞增殖和侵袭能力增强,高浓度EGF(200ng/mL)的作用则相反,与EGF在头颈鳞癌细胞的作用一致[9]｡但目前关于EGFR信号通路调控胶质瘤细胞增殖和侵袭转移分子机制的报道很少｡

本研究发现EGF(100ng/mL)可以促进人胶质瘤U87细胞增殖,但是细胞生长率在24h和48h之间没有时间依赖性,这种促进细胞增殖的作用可以被EGFR抑制剂——AG1478阻断｡同时研究发现EGF可以活化EGFR及下游信号通路,导致P-EGFR和P-AKT的表达上升,与众多研究结果一致[7-8]｡由此推测,EGFR-PI3K/AKT信号通路参与 U87细胞生长和增殖的调控｡

侵袭转移是恶性肿瘤的主要特征之一｡细胞外基质(ECM)是肿瘤侵袭转移的天然屏障,ECM的破坏是肿瘤细胞侵袭转移的前提｡基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)是一组可降解ECM分子的锌依赖性酶,可降解基底膜的ECM成分[9],在肿瘤侵袭转移过程中起到非常重要的作用,其中MMP-2和 MMP-9最为重要｡国内学者报道EGF促进结肠癌细胞对ECM黏附和体外侵袭力的同时,伴有MMP-2/组织型金属蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)和 MMP-9/组织型金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)mRNA比值的升高;而阻断EGFR后具有抑制细胞异质黏附力和体外侵袭力作用,同时MMP-2/TIMP-2 和 MMP-9/TIMP-1mRNA 比 值 减 少[7-8]｡Ellerbroek等[10]报道EGF诱导的卵巢癌细胞 MMP-9蛋白表达涉及EGFR下游PI3K和MAPK信号通路｡本研究中Transwell小室体外侵袭实验表明EGF提高U87细胞的侵袭能力,同时研究也 发 现 EGF促进 MMP-2和 MMP-9的 表 达,AG1478可以降低MMP-2和 MMP-9的表达,减弱U87细胞的侵袭能力｡

总之,本研究结果表明,EGFR-PI3K/AKT信号通路参与调节U87细胞生长､增殖和侵袭转移过程,其机制可能是EGFR-PI3K/AKT信号通路活化后,导致 MMP-2和 MMP-9蛋白的表达增加,对ECM的破坏增强｡

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Molecular mechanism of EGFR sinalinathwamediatininvasion and metastasis of U87 lioma cell line

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(1.;2.,,,, 443003,;3.,,,, 430030,)

ObjectiveTo study the relationship between EGFR signal pathway and invasion and metastasis of U87glioma cells,and discuss the molecular mechanism.MethodsU87glioma cells were cultured in medium that contained epidermal growth factor(EGF 100ng/mL)or epidermal growth factor inhibitor——AG1478(10μmol/L)or combination,then the methyl thiazolyl tetrazolium (MTT)assay and transwell chamber were used to detect the proliferation and invasive ability of U87glioma cells;Expression levels of matrix metalloproteinases-2(MMP-2),matrix metalloproteinases-9(MMP-9)were determined by gelatinase zymography electrophoresis;Western blot was used to determine the expression levels of phosphorylation of the epidermal growth factor receptor(P-EGFR),and phosphorylation of protein kinase B(P-AKT).ResultsExogenous EGF(100ng/mL)increased the expression levels of P-EGFR､P-AKT,the growth ratio increased 19.25%,22.32%(P0.05)at 24,48hrespectively after treated,increased the number of invasion cell from (27±4)cells to(126±3)cells(P0.05),and increased the expression levels of MMP-2,MMP-9;AG1478could block the effects of EGF increased the expressions of P-EGFR,P-AKT in time-independent(P0.05),decreased the invasive ability of U87glioma(P0.05),inhibited the expression of MMP-2,MMP-9(P0.05).ConclusionThe EGFR-PI3K/AKT signaling pathways involved in the regulation of U87glioma cells proliferation and invasion and metastasis.Its mechanism is possible that after the EGFR-PI3K/AKT signaling pathways activated,caused the high expression of MMP-2,MMP-9and increased the damage to the exracellular matrix(ECM).

glioma;receptor,epidermal growth factor;matrix metalloproteinases;neoplasm metastasis;tumor cells,cultured

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.011

A

1671-8348(2012)18-1818-03

#现工作于荆州市第二人民医院｡△

,宜昌市夷陵大道183号宜昌市中心人民医院神经外科｡

2011-11-29

2012-02-21)

•论 著•