乳中抗生素残留及其检测方法的研究进展

陈云，李洪亮，张冬洁，赵树平，于景华,2

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.天津科技大学，天津 300457）

乳中抗生素残留及其检测方法的研究进展

陈云1，李洪亮1，张冬洁1，赵树平1，于景华1,2

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.天津科技大学，天津 300457）

介绍了乳中抗生素残留的原因、抗生素残留的种类以及国内外应用于乳中抗生素的检测方法，同时对不同种类抗生素的测定方法进行比较，为乳中抗生素检测新方法开发提供理论依据。

抗生素；牛奶；检测方法；残留

0 引 言

近年来，牛奶中抗生素残留问题日益受到人们的注目。据调查，目前我国一般奶牛场中奶牛乳腺炎等疾病的患病率在30%左右[1]。为了预防和治疗乳牛的各种疾病，乳牛常被注射和饲喂各种有关的抗生素药物，不可避免的会造成牛奶中抗生素的残留；另外，奶牛在摄取的饲料中也可能含有多种抗生素类药物。在欧美国家多年前即以法规禁止抗生素残留超限量的牛奶上市。不含有抗生素残留已成为国际市场原料奶的收购标准[2]。在我国，食品卫生国标中牛奶中抗生素残留允许量仍是一个空白，2001年9月农业部发布了《无公害食品生鲜牛奶》行业标准，这个标准对生鲜牛乳的卫生指标明确了“抗生素不得检出”[3]。因此，降低原料乳中抗生素的残留水平和控制其危害是目前我国乳品加工企业所面临的难题，开发高效准确的抗生素检测方法是降低乳制品中抗生素的关键所在。

1 乳中抗生素残留的原因及其危害

牛乳中抗生素残留的主要原因是非治疗目的的用药、治疗目的的用药和非法人为掺杂。非治疗目的的用药主要指在牛饲料中添加含有一定比例的抗生素的饲料添加剂，作用是预防疾病，这是牛乳中抗生素残留的重要原因；另一方面，利用抗生素治疗乳牛临床型、隐性型乳房炎和子宫内膜炎，其中乳管注药法就是让药物直接注入乳房，通过乳腺管进入某个已感染区进行消炎，乳牛在接受这种治疗后，乳中的药物残留期可延缓到停药3～5d后[4]。美国食品和药品管理局（FDA）调查表明，泌乳期乳牛用药不当或不注意安全是牛乳中抗生素残留的主要原因[5]。

牛乳中抗生素残留可导致牛乳的发酵不能正常完成或出现异常发酵，不利于发酵乳制品的生产；有些药物本身具有抗原性，直接刺激机体产生抗原抗体反应，造成过敏反应，如青霉素类药物分子的基团可以直接与蛋白质或多糖发生共价结合反应，形成完全抗原，产生免疫活性，严重者甚至危及生命；动物在反复接触某种抗菌药物（尤其是饲料药物添加剂）情况下，体内耐药菌株大量繁殖，耐药菌株可通过动物性食品传播给人，给医学临床感染性疾病的治疗造成困难[6]。正常人体内寄生着大量菌群，如果长期与动物性食品中低剂量的抗菌药物残留接触，就会抑制或杀灭敏感菌，耐药菌或条件性致病菌大量繁殖，微生物平衡遭到破坏，人与动物易发感染性疾病，如四环素类药物引起的二重感染[7]。

联合国粮农组织（FAO）及世界卫生组织（WHO）在1969年提出，应对各种动物性食品中的抗生素残留提出允许标准，并建议在乳牛中接受抗生素治疗停药后至少3 d（最好5～9 d）内的乳汁不能作为食用乳的原料。美国食品和药品管理局（FDA）规定每毫升牛乳中的抗生素残留不得超过0.006国际单位,使用抗生素的牛乳在96h内应废弃。我国1990年11月颁布的乳与乳制品管理办法第4条明确规定，乳牛在应用抗生素期间和停药后5 d内的乳汁不得供食用[4]。

2 乳中常见抗生素种类

四环素类抗生素：金霉素、土霉素、四环素、强力霉素等；磺胺类抗生素：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲基嘧啶等；氯霉素类抗生素：氯霉素，甲砜霉素，氟甲砜霉素等；大环内酯类抗生素：红霉素、秦乐霉素、林可霉素、螺旋霉素和盐霉素等；氨基糖甙类抗生素：链霉素、庆大霉素、二氢链霉素、新霉素、壮观霉素等；β-内酰胺类抗生素：青霉素类、头孢霉素类；喹诺酮：氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星、替米考星等；其他抗生素：林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等。

3 牛乳中抗生素残留检测方法

根据WHO提供的数据，欧盟药典确定了食品中各种抗生素最大残留量限制（MRL），同时欧盟规定食品中兽药的残留量必须与国际认可的其他法规（如国际食品法典委员会的法规）相一致。为了使原料乳和乳制品中抗生素残留量符合MRL要求，乳牛场、乳制品厂、政府监督部门都在努力寻求准确可行的抗生素检测方法，许多大型化学试剂和仪器公司也在致力于开发抗生素残留量的检测方法和仪器。目前牛乳中抗生素残留的检测方法主要有：微生物受阻检测法、理化检测法、免疫学分析法。

3.1 微生物受阻测定法

微生物受阻检测法，又称微生物抑制实验，抑菌圈试验、浑浊度试验均属于此类，大量样品中抗生素的残留物测定通常采用MIT（Microorganism Inhibitory Test）法[8-10]。根据抗生素对特异微生物的生理机能、繁殖代谢的抑制作用来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留量，是检测乳中抗生素较经典且应用较广泛的方法。

3.1.1 TTC法

TTC法（trypheye tetrazolium chloride），即氯化三苯基四氮唑法，最早由Neel和Calbert二人在1955年提出，能检出牛乳中青霉素含量为0.004 U/mL[9,11]。这是目前我国食品卫生标淮中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法（GB/T4789.27-2003），如果牛乳中有抗生素存在，当乳中加入菌种（嗜热链球菌），经培养后不增殖时，加入的TTC指示剂不发生还原反应，鲜乳仍呈无色状态，判定为抗生素阳性；如果没有抗生素存在，则加入菌种即行增殖，TTC被还原变成红色，使样品染成红色，判定为抗生素阴性，一般在培养2.5 h以上可得出判定结果。

3.1.2 纸片法

纸片法，即PD法（Paper Disc），常用的纸片法有枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片法。这两种方法主要用来检测牛奶中的β-内酰胺类抗生素。其操作过程基本相同：将一吸满受检乳样的滤纸圆片放入一接种枯草杆菌的琼脂平皿上，并放入一含有标准抗生素的阳性对照圆片。将培养皿在32℃下培养17～24 h，然后观察有无抑菌圈，若要判定结果是否为真阳性，则需将乳样在82℃下加热2～3 min，冷却，再重复试验。该方法对乳样中青霉素残留的检测限可达0.01 IU/mL。乳中的一些抗菌物质如溶菌酶、乳铁蛋白等会影响试验结果。而嗜热脂肪杆菌纸片法仅用于检测奶样中β-内酰胺类抗生素，并能暗示是否还存在其它抑菌物质，检测限可达0.008 IU以下。一般在4h内即可获得有关乳中是否还存在β-内酰胺抗生素残留的结果[14]。

3.1.3 Delvotest法（戴尔沃检测法）

该方法属于微生物测定法，其试剂是由荷兰DSM公司生产并由AOAC认证[12]。原理是利用微生物—嗜热芽孢菌在64℃条件下培养2.5～3 h后会产酸，酸引起指示剂BCP（溴甲酚紫）变成黄色；若样品中不含有抗生素，培养后样品呈黄色；若样品中含有抗生素，嗜热芽孢菌生长受到抑制而无法产酸，指示剂不变色。

3.1.4 ECLIPSE50试剂盒法

西班牙ZEU-INMUNOTEC公司生产的抗生素检测试剂盒ECLIPSE 50是一种微孔板，每个微孔中含有散播了芽孢杆菌的琼脂培养基和pH指示剂。当在（65℃±1）下培养微孔板时，孢子发育生长，进而降低了培养基的pH值，在pH指示剂的作用下，原来的蓝（紫）色将会变为绿-黄色。如果生鲜牛乳中的抗生素残留浓度高于试剂盒的检测限值，微生物的生长和酸的产生将会受到抑制，由于没有酸生成，颜色将不会改变[13]。

3.1.5 管碟法

由Foster和Wood Ruff于1944年创建管碟法，其原理就是用含有敏感菌的琼脂做成平皿，上面放小管，管中放已知抗生素标准溶液和待测溶液，经过培养后，抗生素标准溶液周围不长细菌，即为抑菌圈，如待测溶液也出现抑菌圈表示含有抗生素。1958年，美国FDA将藤黄八迭球菌（Sarcinalntea）管碟法作为法定的方法，检测青霉素的敏感度为0.01 U/mL[14]。

3.2 理化检测法

理化检测方法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、比色法和荧光分光光度法等。而牛奶中抗生素残留检测最为常用的理化检测方法是高效液相色谱法和色谱质谱联用技术，但其样品前处理繁琐，检测费用较高，且不像微生物检测法具有广谱性。

3.2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱（HPLC）是目前广泛应用的一种理化检测方法，它引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效率高和操作自动化。高效液相色谱法测定牛奶中的药物残留都要经历样品处理（包括样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤）、残留药物的分离和残留药物的检测[15-16]，薄海波等研究了超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中聚醚类抗生素残留量[17]，范志影建立高效液相色谱法测定牛奶中四环素、土霉素、金霉素、强为霉素等4种抗生素残留的方法[18]。

蒋定国等利用高效液相色谱法测定牛奶中磺胺二甲嘧啶，此法样品前处理步骤较简单，净化效果好，回收率高，精密度好，磺胺二甲嘧啶的最小检出浓度为1.2 μg/L[19]。而反相HPLC发展最快,目前已成为大多数抗生素残留的常规分析方法。彭莉等报道了用高效液相色谱法检测牛乳中氯霉素的残留量,采用乙酸乙酯提取牛乳中残留的氯霉素，用紫外检测器在278 nm检测样品，平均回收率为94.8%，变异系数＜12.0%,此方法样品前处理简单，回收率高，实用性强，检验灵敏度高，重现性好，检测数据准确可靠，可作为牛乳中氯霉素残留检测的确证方法[20]。

3.2.2 联用技术

各种分析技术联用是现代兽药残留分析及整个分析化学方法上的发展特点。常用的联用技术有薄层液相色谱和质谱联用（TLC-MS）、气相色谱和质谱联用（GC-MS）、液相色谱和质谱联用（LC-MS）、毛细管区域电泳和质谱联用（CIE-MS）、液相色谱和核磁共振波谱联用（LC-NMR）、超临界流体色谱和质谱联用（SFC-MS）等。

1989年，Voyksner等人基于液谱—热喷雾质谱（LC-TS-MS）方法提出了一种简单快速检测牛乳中青霉素G的分析方法[21]。2001年Bruno研究出一种准确的检测方法，可精确分离和定量乳中低于美国和欧盟规定耐受量的10种允许使用的β-内酰胺类抗生素[22]。

3.3 免疫分析法

免疫分析法的基本原理是以抗原或半抗原和抗体特异性结合为抗原—抗体复合物的以免疫反应为基础的生化测试技术。目前应用的残留免疫分析技术可分为2个基本类型。

（1）相对独立的分析方法，即免疫测定法（IAS），包括放射免疫测定法（RIA）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、固相免疫传感器等。竞争ELIsA法应用于牛奶中抗生素的检测比较广泛的直接竞争ELISA.

（2）免疫净化法。将免疫分析技术与常规理化分析技术联用。其中最常用的是免疫亲和色谱法（IAC）[23]。

3.3.1 SNAP快速抗生素测定仪

SNAP快速抗生素测定法，是酶联免疫分析法（ELISA）的一个变换形式。它是利用竞争性原理，使样品内的抗生素与内置抗生素标志物竞争性地与固定的抗体或广谱受体结合，然后进行冲洗和显色。最终的反应结果是当颜色越深或光度强时表示阴性，反之表示阳性。Snap属于快速的检测方法，反应时间不到10 min,正因为快速其检测面就相对比较窄，准确率相对于微生物受阻检测法低一些,而且所使用的仪器和试剂成本很高[24-25]。

SNAP操作步骤：加乳样于样品管中，摇匀，加热样品和检测板5 min，加入乳样于样品孔中，当激活圆环开始退却时按snap键，反应4 min由snap读数仪读取并打印结果[26]。

3.4 分子印迹技术

分子印迹技术以目标待测物为模板分子，将具有结构上互补的功能化聚合物单体通过共价或非共价键与模板分子结合，并加入交联剂进行聚合反应。反应完成后将模板分子洗脱出来，形成的一种具有固定空穴大小和形状及有确定排列功能团的交联高聚物。这种交联高聚物即为分子印迹聚合物（Molecular Imprinting Polymers,MIP）[27]。待测物质由于与MIP的识别位点在形状、大小和功能基团的定位方面吻合而被特异性识别，因此在特异性上可与生物抗体相媲美，同时具有一定的机械和化学强度，对酸、碱、有机溶剂、温度和压力均有一定的耐受性，且比生物抗体易于合成和贮存，是分子识别理想的工具，在SPE[28]、药物的手性分离[29]、传感器[30]、模拟抗体和模拟酶[31]、农药检测等方面有广泛的应用。

王慧等应用分子印迹方法合成了对青霉素有特异性吸附能力的印迹聚合物PenG-MIP，与本尼迪特（Benedict）试剂结合分析确定了，PenG-MIP在牛乳中的吸附平衡时间为6 h，选择性吸附实验表明在牛乳中青霉素印迹聚合物对青霉素表现出高特异性。用一定量颗粒吸附处理含有青霉素的牛乳，再进行发酵活性实验，通过颗粒的用量及发酵情况确定乳中青霉素的残留量，实现分子印迹技术用于乳中青霉素残留的快速定量检测，检测下限为5 μg/L或以下，结果准确度高，操作简便，且PenG-MIP颗粒可以反复使用，极大的降低了检测的成本[32]。

4 结束语

纵观以上牛乳中抗生素的残留检测方法，微生物受阻法可靠性高、操作简单、费用低，但必须经过几小时的培养过程才能观察到结果。理化检测法敏感性较高，准确度高，但前处理较复杂，费用较高。免疫受体检测法虽然速度快，灵敏度高，特异性强，但容易出现假阳性。随着广大消费者对无抗奶需求呼声不断提高，牛乳抗生素残留检测方法已成为乳品企业所面临的难题，需要开发出快速且灵敏度高的抗生素检测方法，来提高乳品的质量和乳品企业的竞争力。

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Study on the residues and detected methods of antibiotics in milk

CHEN Yun1,LI Hong-liang1,ZANG Dong-jie1,ZHAO Shu-ping1,YU Jing-hua1,2
（1.Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry Co.Ltd.，Hohhot011500，China；2.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

In this paper,the residues and categories of antibiotics existed in milk were introduced.The different detected methods were described and compared at home and abroad,from which we can obtain theories to develope new detected method for antibiotics in the milk.

antibiotics；milk；detected methods；residues

TS252.7

B

1001-2230（2012）09-0035-04

2012-03-22

陈云（1980-），男，硕士，研究方向为乳及乳制品研究开发。