地黄低聚糖对体外培养的小型猪脂肪组织来源干细胞增殖的影响

裴志勇，赵玉生，高伟，尹巧香

(1.北京军区总医院干部病房一科，北京100700;2.解放军总医院老年心血管病研究所;3.空军总医院干部病房心内科)

地黄是一味重要的滋阴补肾中药，大量临床和实验研究证实其在免疫、血液及造血、内分泌、心血管、神经系统等方面具有广泛的药理活性。地黄低聚糖(RGOs)系从地黄中提取的低分子量多糖成分，体外研究表明，RGOs具有促进动物骨髓干细胞、骨骼肌成肌细胞增殖、分化的功能［1-3］。脂肪组织来源干细胞(ASCs)是近10年发现并引起学者们广泛关注的一种成体干细胞，多项研究表明，ASCs体外可分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经细胞、平滑肌细胞和肝细胞［4-6］。而关于RGOs与ASCs的研究较少，本文旨在观察不同浓度RGOs对体外培养的小型猪ASCs增殖的影响，为中药用于干细胞移植提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 广西巴马小香猪，雌雄不拘，体质量20～30 kg，由解放军总医院实验动物中心提供，许可证号:SYXK(军)2007-009。RGOs以生地黄为原料加工后经军事医学科学院毒物药物研究所提纯，高效液相色谱法检测RGOs提纯物中水苏糖含量为31.15%。L-DMED培养基、特级胎牛血清(FBS)、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶均购自Gibco公司，DispaseⅡ中性蛋白酶购自Sigma公司，小鼠抗CD31单克隆抗体、小鼠抗CD90单克隆抗体均购自BD PharmingenTM公司，小鼠抗 CD29单克隆抗体、大鼠抗CD44单克隆抗体、小鼠抗CD45单克隆抗体、小鼠抗CD105单克隆抗体、小鼠抗HLA-DR单克隆抗体均购自Abcam公司，大鼠抗CD34单克隆抗体购自Santa cruz公司，细胞计数试剂盒-8(CCK-8)购自江苏碧云天生物技术研究所。二氧化碳孵箱(美国Thermo FormaⅡ)，荧光显微镜(德国 Leica DM IRB)，酶标仪(澳大利亚Sunrise 1.5)，流式细胞仪(美国BD FACS Calibur)。

1.2 方法

1.2.1 不同浓度RGOs培养基的制备 将RGOs提纯物1.0 g溶于100 ml含10%FBS的L-DMEM培养基中，配成浓度为10 g/L的培养基母液，倍比稀释成1 g/L、0.1 g/L、0.01 g/L、0.001 g/L浓度的培养基。

1.2.2 ASCs的分离、培养 无菌条件下取小型猪腹股沟区脂肪组织5～8 g，冰PBS冲洗3次，去除血污、筋膜及血管，剪碎呈糊状;加入20 ml消化液(LDMEM+0.1%Ⅳ型胶原酶+0.1%DispaseⅡ中性蛋白酶+0.1%胰蛋白酶)，置于37℃孵箱振荡消化40～60 min;加入等量含10%FBS的L-DMEM培养基终止消化，100目、200目筛网过滤，600 g离心6 min;弃上清，加入含10%FBS的L-DMEM培养基重悬细胞，移入培养皿，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。24 h后首次换液，去除悬浮细胞，随后每2～3天换液1次。1周左右细胞融合80%～90%，加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA溶液消化、传代。倒置显微镜观察原代及传代的ASCs形态学特点。

1.2.3 ASCs的分子表型鉴定 取第4代细胞，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA溶液消化后PBS重悬细胞并计数，细胞密度调至1×106/ml;取9只EP管，分别加入0.5 ml细胞悬液，1000转/min离心5 min，PBS清洗两遍;0.5 ml PBS再次重悬细胞，加入以下抗体:CD29-FITC、CD31-PE、CD34(一抗)、CD44-FITC、CD45(一抗)、CD90-FITC、CD105-FITC、HLA-DR-FITC(对照加入20 μl PBS)，混匀后4℃冰箱静置30 min;1900转/min离心8 min，弃上清; CD34及CD45两只EP管的细胞再次用0.5 ml PBS重悬，加入相应的二抗(均为FITC)，混匀后4℃冰箱静置30 min，1900转/min离心8 min，弃上清;各管均加入2%多聚甲醛0.5 ml，4℃固定30 min。流式细胞仪进行阳性细胞计数，每次分析获取2×104个细胞，Cell Quest软件进行数据分析。实验重复3次。

1.2.4 CCK-8法测定ASCs的增殖 取第3代细胞，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA溶液消化后计数，细胞密度调至2×104/ml。取9块96孔板，每块板分为以下7组:空白对照组，A、B、C、D、E、F组(分别含0 g/L、0.001 g/L、0.01 g/L、0.1 g/L、1 g/L、10 g/L的 RGOs)。每组重复 5孔，每孔加100 μl细胞悬液，外周一圈加入100 μl PBS。置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。平衡24 h后吸弃原培养基，根据不同分组加入不同浓度的RGOs培养基，每2天换液1次。随后每24 h随机取一块96孔板，加入10 μl CCK-8试剂，置于37℃、5%CO2培养箱继续孵育2 h，酶标仪测定各孔波长450 nm吸光度(OD450)。计算各组矫正的OD450值，公式如下:矫正的OD450值=不同浓度RGOs组OD450值－空白对照组OD450均值，以时间(d)为横坐标，矫正的OD450均值为纵坐标，绘制生长曲线。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计学软件进行分析。计量资料以±s表示，多组之间比较先采用F检验而后进行q检验。

2 结果

2.1 小型猪ASCs的形态学观察 原代细胞接种24 h后首次换液，可见大量贴壁细胞，多呈圆形或椭圆形，少数呈梭形、三角形或多角形，有粗大突起，核居中，细胞质内可见大量大小不等透明圆泡及细小颗粒。72 h后，细胞较前伸展变大，形状如前。7 d左右细胞融合达80～90%，可按1∶3传代。传代后的细胞数小时可完全贴壁，生长较迅速，5 d左右可再次传代。2～3次传代后细胞多呈三角形、多角形或星形。

2.2 ASCs表面抗原表达 第4代ASCs表面抗原表达率如下:CD29(99.07±0.28%)、CD44(98.83± 0.56%)、CD90(97.60±0.44%)、CD105(99.31± 0.48%)、CD31(1.95±0.05%)、CD34(2.33± 0.37%)、CD45(1.94±0.04%)、HLA-DR(0.35± 0.02%)。提示第4代ASCs表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达，而CD31、CD34、CD45、HLA-DR均呈阴性。

2.3 不同浓度RGOs对ASCs增殖的影响 如图1示，小型猪ASCs增殖曲线呈“S”形，前3天细胞增殖缓慢，处于相对静止期;第4天至第6天细胞增殖迅速，呈指数增长;第7天至第9天细胞增殖处于平台期。从第4天开始，不同浓度RGOs对ASCs增殖的影响出现明显差异，其中D组(0.1 g/L)促增殖作用最明显，其次是C组(0.01 g/L)，均优于A组、B组及F组(均P＜0.05);而E组(1 g/L)的促增殖作用从第6天开始优于A组、F组及B组(均P＜0.05);而极低浓度(0.001 g/L)的B组及极高浓度(10 g/L)的F组无明显的促增殖作用(P＞0.05)。

3 讨论

近年来，干细胞移植治疗急性心肌梗死及心力衰竭成为心血管领域研究的热点。目前研究比较多的是骨髓干细胞，尤其是骨髓间充质干细胞(BMSCs)及骨髓单个核细胞。但骨髓干细胞来源有限，取材时痛苦，纯化率低;另外，骨髓中干细胞的比例及增殖能力都会随年龄的增长逐渐下降，因而其广泛应用受到一定限制。2001年，Zuk等［4］首次从人脂肪组织中分离出成纤维样细胞群，发现它可以自我更新，并具有向脂肪、软骨、骨、肌细胞方向分化的潜能，称这些细胞为ASCs。与胚胎干细胞、BMSCs、骨骼肌成肌细胞、骨髓造血干细胞相比，ASCs具有以下优点:①来源充足，取材方便;②获取效率高;③体外扩增能力强;④免疫原性极低，可异体移植，不涉及免疫排斥及伦理学问题。以上优势使ASCs逐渐成为近年研究的热点。

作为一种间充质干细胞，ASCs没有特异性表面标志物。干细胞治疗国际协会-间质及组织干细胞委员会［7］针对人的间充质干细胞初步制定了4条标准:①可黏附性;②具有成脂、成骨及成软骨分化的能力;③表达CD73、CD90、CD105;④不表达造血系标志物如c-kit、CD14、CD11b、CD34、CD45、CD79α、CD19及HLA-DR。CD29即整合素β-1，是骨髓基质中重要的黏附分子纤粘蛋白及VACM-1的配体，在介导干细胞归巢及促进血管形成中起重要作用［8］。CD44即透明质酸受体，在细胞基质的形成中起了重要作用，与干细胞的黏附、增殖、迁移有关。CD31、CD34是内皮细胞的表面标志物，CD31、CD34阴性说明分离培养的ASCs没有受到脂肪中微血管内皮细胞的“污染”。CD45是造血干细胞的表面标志，CD45阴性说明所分离培养的细胞并非来源于循环中的干细胞。CD105是常用的鉴定细胞具有多方向分化潜能的细胞表面标志。本实验对所分离、培养的细胞经流式细胞仪检测，结果显示细胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105呈阳性表达，而 CD31、CD34、CD45、HLA-DR呈阴性表达。初步证实本实验所分离的ASCs具有黏附、增殖、迁移的特性，并具有多向分化的潜能，是脂肪组织来源的间充质干细胞。

现代中医理论认为，干细胞从产生到发挥功能均与传统中医理论中的“先天之精”密切相关［9］。中医学的“精”主要有繁衍生殖、生长发育、生髓化血、濡养脏腑四大功能，这是“精”学说指导中医学临床实践的主要理论依据。中医经典理论认为藏腑中的“肾”是成年个体储存“先天之精”器官。肾为先天之本，内藏五脏之精，主骨生髓，先天之精及后天脏腑之精均归于肾，对于成年个体而言，中医范畴的“肾”是“精”的源泉［10］。因此，具有补肾、益气、养血功能的地黄可能对干细胞的生物学特性发挥效应。

RGOs系地黄糖类成分中一类分子量为1 000～3 000的多糖，主要由60%的四糖和20%的三糖构成，水苏糖是其中的主要成分之一。本研究发现，RGOs在一定浓度范围(0.01～1 g/L)内可促进体外培养的小型猪ASCs的增殖，最佳浓度为0.1 g/L。本研究还发现，较高浓度时RGOs的促增殖效应并不随之增强。这种现象可能与如下因素有关:植物性多糖是一种大分子物质，不能自由通过细胞膜，当多糖与受体作用时分子中只有几个低聚糖片段与受体结合，由此推测多糖也象蛋白质和酶一样，分子中可能存在一个或多个低聚糖片段的活性中心，同样存在受体饱和现象［11］。另外，中药的双向调节作用可能也是该现象产生的原因之一。尹明等［2］研究发现，RGOs可以促进离体大鼠骨骼肌成肌细胞增殖，最佳浓度为0.625 g/L。王玉红等［12］研究发现，0.1 g/L及0.4 g/L两种RGOs培养基均可以促进人ASCs增殖，其中前者促增殖作用最强。以上研究均说明RGOs在一定剂量范围内可以促进干细胞的增殖，其最佳作用浓度差异可能与物种、干细胞类型以及所提取RGOs有效成分含量不同有关。综上所述，RGOs是地黄中具有促干细胞增殖作用的活性成分。这不仅为RGOs用于干细胞移植，提高移植疗效提供了有力的实验依据，并且还为地黄在心血管疾病方面的应用开辟了新天地。