从黄芩茎叶粗提物中制备野黄芩苷的研究

史高峰，祝娟娟，陈学福，王国英，陈英赞，蒲凌云

(兰州理工大学石油化工学院，甘肃兰州730050)

黄芩茎叶为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeogi的干燥茎叶［1］。传统药用部位为黄芩的根，地上茎叶部分被视为非药用部分而被弃去，主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、河南、山东、四川、云南、山西、陕西、甘肃、内蒙古等地。其主要有效成分野黄芩苷是对心脑血管起效的活性成分［2］，已被制成针剂、药片、胶囊等多种剂型。目前此药物急缺，国内外市场已经不能满足，因此高纯度的野黄芩苷有待大规模的开发。原野黄芩苷的制备主要是从灯盏花中得到［3-5］，现因灯盏花野生资源和种植面积不断减少，且价格高，因此本实验以黄芩茎叶为原料制备野黄芩苷，变废为宝。从黄芩茎叶中制备野黄芩苷的传统工艺［6-9］，主要是采用大孔树脂或聚酰胺树脂进行纯化分离［10-12］，工艺繁琐，工业化造价高。因此本实验建立了一种新的制备方法，碱提酸沉法，对分离过程中影响分离效果的诸因素进行筛选，确定最佳的分离工艺，为黄芩茎叶综合开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 材料黄芩茎叶粗提物，实验室自制。

1.1.2 试剂对照品为野黄芩苷，纯度98%，阿拉丁试剂(中国)有限公司，实验所用试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 仪器U—2001紫外分光光度计，日本日立公司;ZK—82电热真空干燥箱，上海市实验仪器总厂;AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;RE—3000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;KQ5200DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;Surveyor高效液相色谱分析仪，美国Finnigan。

1.2 野黄芩苷的制备工艺流程见图1。

图1 野黄芩苷制备工艺流程

1.3 黄芩茎叶粗提物的制备准确称取经预处理的黄芩茎叶(粉碎)1 000.0 g，用12倍样品质量的70%的乙醇为提取溶剂，70℃提取2.5 h，重复提取3次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，置烘箱内60℃干燥，取出冷却后称定质量，研细，作为黄芩茎叶粗提物，备用。

1.4 从粗提物中分离野黄芩苷影响因子考察

1.4.1 碱提pH的研究准确称取黄芩茎叶粗提物4.0 g，5份，分别加入一定量的沸蒸馏水，搅拌并超声溶解，用15%NaOH调pH至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。滤过，滤液加10%H2SO4，pH均调至1.5。静置36 h，析出棕色沉淀物，倾取上层溶液，再次静置24 h后，析出土黄色沉淀物。分取棕色沉淀物和土黄色沉淀物，过滤，滤饼用蒸馏水，丙酮洗至中性，烘干，用紫外分光光度法检测总黄酮的含有量。

1.4.2 酸沉pH研究准确称取黄芩茎叶粗提物15.0 g，加入一定量沸蒸馏水，搅拌并超声溶解，加入15%NaOH调pH至7.5，趁热过滤，滤液分成5份，加10%硫酸调pH至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5，静置36 h，析出棕色沉淀物，倾取上层溶液，再次静置24 h后，析出棕黄色沉淀物。分取棕色沉淀物和土黄色沉淀物，过滤，滤饼用蒸馏水，丙酮洗至中性，烘干用紫外分光光度法检测总黄酮的含有量。

1.4.3 料液比的研究准确称取等量的黄芩茎叶粗提物，分别按料液比(m∶V)1∶5、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14加入沸蒸馏水，搅拌并超声使溶解，缓缓加入15%氢氧化钠溶液，调pH至约7.5，趁热滤过，滤液缓缓加入10%H2SO4溶液，调pH至0.5。静置36 h，析出棕色沉淀物，倾取上层溶液，再次静置24h后，析出土黄色沉淀物。分取棕色沉淀物和土黄色沉淀物，过滤，滤饼用蒸馏水，丙酮洗至中性，烘干，用紫外分光光度法检测总黄酮的含有量。

1.5 黄芩茎叶粗提物中总黄酮的测定以野黄芩苷为对照品，采用紫外分光光度法测定单因素试验所得沉淀物中总黄酮。

1.5.1 测定波长的确定取野黄芩苷对照品适量，加甲醇溶解，稀释至一定刻度，置紫外/可见分光光度仪中，在200～600 nm扫描，绘制紫外吸收光谱。结果表明野黄芩苷在335 nm处有最大吸收，因此，将测定波长定为335 nm［13］。

1.5.2 标准曲线的制定精密称取野黄芩苷对照品2.5 mg，甲醇溶解并定容至50 mL量瓶，摇匀得质量浓度为0.05 mg/mL的野黄芩苷对照品溶液。分别吸取上述野黄芩苷对照品溶液1、1.5、2.0、2.5、3.0 mL.定容于10 mL量瓶中，在波长335 nm处测量吸光度(A)，以对照品质量浓度(C，mg/mL)为横坐标，以A为纵坐标，得标准曲线A=46.154C－0.017，R2=0.999 8。

1.6 野黄芩苷定性定量分析HPLC条件:色谱柱为Hypersil Gold C18柱(2.1 mm×150 mm，Agilet);流动相为甲醇-0.05%的H3PO4溶液为40∶60［14］;进样室温度:30℃，柱温:40℃;检测波长:335 nm;体积流量:0.2 mL/min;进样量5 μL。

实验所得样品的检测精密称取野黄芩苷样品2.8 mg，用色谱甲醇溶解并定容至10 mL，即0.1 mg/mL，取此样品1.0 μL进样分析。

2 结果与分析

2.1 野黄芩苷分离影响因子考察

2.1.1 碱提pH的研究不同碱提pH对黄芩茎叶总黄酮质量分数和浸膏得率的影响，见图2。

图2 碱提pH对黄芩茎叶浸膏得率和总黄酮质量分数的影响

由图2可知:在一定的pH范围内，黄芩茎叶浸膏得率及总黄酮质量分数随着pH的升高，而逐渐提高。当pH达到7.5左右时，浸膏得率及总黄酮质量分数达到最大。pH继续升高，浸膏得率和总黄酮质量分数呈降低趋势，考虑到过高的pH会使野黄芩苷结构上的葡萄糖基水解，因此，碱提pH选用7.5为宜。

2.1.2 酸沉pH研究不同酸沉pH对黄芩茎叶总黄酮含有量和浸膏得率的影响，见图3。

图3 酸沉pH值对黄芩茎叶浸膏的率和总黄酮质量分数的影响

由图3可知:随着pH的增大，浸膏得率及总黄酮含有量逐渐降低，当pH为2.5时没有沉淀生成。但在pH为0.5时，酸沉得效果最好，浸膏得率及总黄酮含有量为最高。因此，酸沉pH选用0.5较为适宜。

2.1.3 料液比的研究不同料液比对黄芩茎叶总黄酮含有量和浸膏得率的影响，见图4。

图4 固液比对黄芩茎叶浸膏的率和总黄酮质量分数的影响

由图4可知:在料液比为1∶5～1∶12的范围内，浸膏得率及总黄酮含有量随着料液比的增大，而逐渐提高。当料液比超过1∶12后，料液比继续增大，对浸膏得率和总黄酮含有量没有显著提高。因此，考虑成本，料液比选用1∶12为宜。

2.2 HPLC检测野黄芩苷样品色谱图见图5，6。经色谱分析得知:野黄芩苷标准品的保留时间为3.74 min，实验室自制野黄芩苷样品保留时间为3.78 min，其保留时间基本相近，同时样品野黄芩苷色谱峰所对应的紫外吸收波长为335 nm，与文献值相近［14］。经样品的色谱峰面积计算野黄芩苷质量分数达93.7%。

2.3 验证试验准确称取一定量的黄芩茎叶粗提物，按料液比1∶12，碱提pH 7.5，酸沉pH 0.5的条件验证试验。结果黄芩茎叶浸膏得率平均为3.48%，总黄酮质量分数平均值为92.3%，野黄芩苷平均质量分数为92.13%。验证结果见表1。

图5 野黄芩苷标准品HPLC色谱图

图6 实验室自制野黄芩苷样品HPLC色谱图

表1 验证试验结果

3 结论

经碱提酸沉法确定黄芩茎叶粗提物中分离野黄芩苷的最佳参数为:碱提pH为7.5，酸沉pH为0.5，所得沉淀中总黄酮质量分数80%以上，所得沉淀用甲醇溶剂法重结晶，经HPLC检测，质量分数为93.7%。

该制备工艺具有操作简单，生产成本较低的优点，适用于产业化生产，为黄芩茎叶的进一步开发打下了良好基础。

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［14］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:138.