2种保和制剂中齐墩果酸、熊果酸和橙皮苷定量测定及比较分析

杨红，刘亚蓉

(1.山西药科职业学院，山西太原030031;2.青海省食品药品检验所，青海西宁810016)

保和丸始载于《丹溪心法》，是自金元时期记载以来沿用至今的传统中药名方。处方组成:山楂(焦)、六神曲(炒)、半夏(制)、茯苓、陈皮、连翘、莱菔子(炒)、麦芽(炒)。主要功效消食，导滞，和胃。用于食积停滞，脘腹胀满，嗳腐吞酸，不欲饮食。剂型有大蜜丸、水丸、浓缩丸、片剂、颗粒剂等。其中大蜜丸、水丸为传统剂型，全部药材粉碎直接入药，临床上也以大蜜丸、水丸为主，二者市场占有量达到全部保和制剂的60%以上。

大蜜丸、水丸收载于《中国药典》2010年版一部，标准中将橙皮苷作为定量控制指标［1］。本品处方中山楂为君药，占处方量的37.5%，为原粉直接入药，本实验参考有关文献［2-4］选择山楂中所含齐墩果酸、熊果酸作为指标，对保和大蜜丸、水丸中山楂进行定量控制，为更全面控制保和大蜜丸、水丸质量提供了依据。同时对所收集到的6家大蜜丸生产企业的35批样品、4家水丸生产企业的11批样品按照标准方法进行了橙皮苷的测定及比较，按本文方法进行了齐墩果酸、熊果酸的测定和比较分析，为保和大蜜丸、水丸的质量监管提供了依据。

1 仪器和试药

1.1 仪器Waters2695高效液相色谱仪，2487二极管阵列检测器;Milli—QA超纯水器(Millipore)。

1.2 试药乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110742-200415，供定量测定用);齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110709-200304，供定量测定用);橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110721-200512，供定量测定用);样品(6家大蜜丸生产企业的35批样品、4家水丸生产企业的11批样品);阴性药材购自青海九康药业有限公司，阴性样品分别按照大蜜丸、水丸按原标准制备工艺去除焦山楂后制得。

2 方法和结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验SunFireTMC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为甲醇-乙腈-0.5%醋酸铵(5∶66∶29)，柱温30℃，体积流量0.9 mL/min;检测波长210 nm。理论板数按熊果酸峰计算应不低于3 000。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸29.4 mg、熊果酸对照品29.2 mg，分别置100 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL各含齐墩果酸0.294 mg、熊果酸0.292 mg的对照品贮备液，精密量取齐墩果酸对照品溶液2 mL、熊果酸对照品溶液2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液(每1 mL含齐墩果酸58.8 μg、熊果酸58.4 μg)。

2.2.2 供试品溶液制备

大蜜丸取大蜜丸约5 g，精密称定，加硅藻土适量，研细后置索氏提取器中，加入乙醚适量，回流提取4 h，乙醚蒸干，残渣用甲醇-三氯甲烷(5∶1)混合溶液溶解并定容于10 mL量瓶中，微孔滤膜过滤，制得供试品溶液。

水丸取水丸细粉约2.5 g，精密称定，加入乙醚适量，索氏提取器中回流4 h，乙醚蒸干，残渣用甲醇-三氯甲烷(5∶1)混合溶液溶解并定容于10 mL量瓶中，微孔滤膜过滤，制得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备按处方比例称取药材(除焦山楂)适量，分别按照大蜜丸、水丸样品生产工艺制得大蜜丸和水丸的阴性样品。再依照保和丸供试品溶液的制备方法，分别制成大蜜丸、水丸的阴性对照溶液。在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各5 μL，分别注入液色谱仪。供试品色谱图中，在与两种对照品色谱图相应保留时间上，与对照品有相同的色谱峰，分离度大于1.5，阴性对照在此无干扰，见图1、2。

图1 保和丸(大蜜丸)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of Baohe Big Honeyed Pills

图2 保和丸(水丸)HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of Bohe W atered Pills

2.3 线性关系考察分别精密量取上述已配制好的齐墩果酸(质量浓度为0.294 mg/mL)、熊果酸(质量浓度为0.292 mg/mL)贮备液0.5、1、2、4、8、10、12 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容，分别精密吸取上述对照品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定。计算回归方程为:齐墩果酸Y=13 064 278.2X，R=1;熊果酸Y=9 532 773.4X，r=0.999 9。齐墩果酸、熊果酸分别在0.029 4～0.705 6 μg、0.029 2～0.700 8 μg的范围内有良好的线性关系。

2.4 精密度试验精密吸取上述已配制好的齐墩果酸、熊果酸对照品溶液(每1 mL含齐墩果酸58.8 μg、熊果酸58.4 μg)，连续进样5次，每次进样量为10 μL，结果齐墩果酸、熊果酸RSD分别为2.1%、0.60%。

2.5 重复性试验取同一批号大蜜丸样品(河北某药业有限公司，批号:090204)的样品5份，水丸样品(河北某制药有限公司，批号:090702)按供试品溶液的制备项下的方法制成供试品溶液，每份样品进2针，在上述色谱条件下，测定样品齐墩果酸、熊果酸的峰面积，以外标法计算含量。结果大蜜丸齐墩果酸、熊果酸RSD分别为2.0%、1.8%;水丸齐墩果酸、熊果酸RSD分别为1.6%、1.2%。

2.6 稳定性试验取同一份大蜜丸供试品溶液，水丸供试品溶液按上述色谱条件分别于0、1、2、4、6、8 h测定，结果大蜜丸齐墩果酸、熊果酸RSD分别为2.2%、1.7%;水丸齐墩果酸、熊果酸RSD分别为2.0%、1.3%，说明样品溶液在配制后8 h内稳定。

2.7 加样回收率试验取已测定的大蜜丸(齐墩果酸质量分数为0.13 mg/g、熊果酸质量分数为0.46mg/g)9份，每份称取约2.5g，精密称定，分别精密加入齐墩果酸贮备液(0.294 mg/mL)1.30、1.10、0.90 mL各3份、熊果酸贮备液(0.292 mg/mL)5.00、4.00、3.00 mL各3份。取已知测定的水丸样品(齐墩果酸质量分数为0.22 mg/g、熊果酸质量分数为0.52 mg/g)9份，每份称取约1.25g，精密称定，分别精密加入齐墩果酸贮备液(0.294 mg/mL)1.10、0.90、0.70 mL各3份、熊果酸贮备液(0.292 mg/mL)2.60、2.20、1.80 mL各3份。按供试品溶液制备项下的方法制成供试品溶液，并按上述色谱条件测定并计算回收率，结果大蜜丸齐墩果酸、熊果酸平均回收率分别为97.80%、97.60%，RSD分别为1.20%、0.98%;水丸齐墩果酸、熊果酸平均回收率分别为98.85%、99.27%，RSD分别为1.06%、1.10%。保和丸2种剂型加样回收结果见表1。

3 样品测定

3.1 齐墩果酸、熊果酸的测定按照上述样品测定方法对收集到的来自6家生产企业的35批大蜜丸样品、4家16批水丸样品中齐墩果酸和熊果酸进行了测定，测定结果见表2，并根据大蜜丸、水丸的服用量对齐墩果酸和熊果酸的摄入量进行了比较，结果见表3。

3.2 橙皮苷的测定按照《中国药典》2010年版一部方法对收集到的来自6家生产企业的35批大蜜丸样品、4家16批水丸样品中橙皮苷进行了测定，测定结果见表2，并根据大蜜丸、水丸的服用量对橙皮苷的摄入量进行了比较，结果见表4。

4 讨论

4.1 取已配制好的齐墩果酸、熊果酸对照品溶液，进行紫外扫描(200～400 nm)，二者均在206 nm附近有最大吸收，所以定210 nm为检测波长。

4.2 根据文献报道，分别采用甲醇-水-醋酸［2］、甲醇-水-冰乙酸-三乙胺［3］，甲醇-0.5%磷酸溶液［4］，乙腈-水［5］，乙腈-水-磷酸［6-7］，乙腈-1%冰醋酸溶液［8］，甲醇-水-磷酸［9］，乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液［10-11］，乙腈-甲醇-0.6%醋酸铵溶液［12］作为流动相，结果表明，乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵分离效果较好。在此基础上进行优化，最终确定流动相为乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵(66∶5∶29)。

4.3 根据齐墩果酸、熊果酸的化学性质及文献报道［2-7］，分别采用甲醇、无水乙醇、75%乙醇、乙醚作为提取溶媒，实验结果表明，用无水乙醇、75%乙醇、甲醇提取的供试品溶液颜色较深，色谱峰杂质多，难达到基线分离，用乙醚提取的供试品溶液颜色较浅，杂质少，分离效果较好。

4.4 提取方法，分别采用超声、水浴回流、索式回流提取样品各1 h，实验结果表明索式回流提取的提取率高。

4.5 大蜜丸、水丸中齐墩果酸和熊果酸测定结果表明，大蜜丸生产企业所用山楂原料较为稳定、均一，按次服用齐墩果酸和熊果酸量计，6家生产企业之间及各生产企业不同批次间药品质量比较稳定。4家水丸生产企业药品所含齐墩果酸和熊果酸量普遍较大蜜丸高，且个别生产企业不同批次间齐墩果酸和熊果酸量波动较大，每丸齐墩果酸和熊果酸量的最大值是最小值的6倍多，单次服用摄入量差异更大，因此增加并统一保和大蜜丸、水丸中齐墩果酸和熊果酸的定量控制，更能有效控制药品质量均一性，以保证用药的有效性。

表2 大蜜丸、水丸中橙皮苷、齐墩果酸、熊果酸测定结果(n=4，RSD≤2%)Tab.2 Determ ination resultes of hesperidin，aleanolic acid and ursolic acid in sam p les(n=4，RSD≤2%)

表3 大蜜丸和水丸齐墩果酸、熊果酸测定结果分析及服用量比较Tab.3 Content analyses and oral dose comparison of aleanolic acid and ursolic acid

表4 大蜜丸和水丸橙皮苷测定结果分析及服用量比较Tab.4 Content analyses and oral dose com parison of hesperidin

4.6 大蜜丸、水丸中橙皮苷测定结果表明，同一生产企业样品不同批次橙皮苷定量较稳定，不同生产企业样品之间样品橙皮苷定量差异较大。各生产企业药品在符合现行标准的最低要求前提下，质量存在参差不齐的情况，使得患者在服用不同生产企业药品后疗效可能出现差异。中药成方制剂的定量测定项仅有下限控制而无上限控制，是造成不同生产企业样品之间质量差异的原因之一。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:931-933.

［2］陈战国，金燕子，李强.RP-HPLC测定保和丸(浓缩丸)中齐墩果酸、熊果酸的含量［J］.中国中药杂志，2006，31(19):1630-1632.

［3］谢莹，杭太俊，程赞.高效液相色谱法测定中药中齐墩果酸和熊果酸含量［J］.中国中药杂志，2001，26(9):615-616.

［4］白雪梅，付煜荣，田嘉铭.高效液相色谱法测定大山楂丸和山楂鲜果中齐墩果酸及熊果酸的含量［J］.中国医院药学杂志，2006，26(8):981-982.

［5］李琴韵，张雷.HPLC法测定左归颗粒中熊果酸和齐墩果酸的含量［J］.中国中药杂志，2005，30(4):308-309.

［6］李琦，马俊艳.HPLC法测定大山楂丸中熊果酸的含量［J］.中国药事，2008，22(1):54-55.

［7］刘永华.山楂叶中熊果酸的HPLC法比较分析［J］.中成药，2005，27(3):318.

［8］梁恕坤，付庆霞，冯尚彩.HPLC法同时测定山楂叶提取物中7种主要成分［J］.齐鲁药事，2009，28(1):20-22.

［9］范志英.HPLC测定无刺枸骨不同部位中齐墩果酸和熊果酸的含量［J］.浙江中医杂志，2010，45(2):144-145.

［10］黄秋妹，梁健华.山楂降脂片中熊果酸和齐墩果酸的含量测定［J］.今日药学，2009，19(3):23-25.

［11］黄秋妹，李宗.HPLC法测定山楂中熊果酸和齐墩果酸的含量［J］.海峡药学，2007，19(3):43-45.

［12］詹学雄，欧秀莉.山楂精降脂片及其原料熊果酸含量的研究［J］.海峡药学，2009，21(1):43-46.