胚胎干细胞诱导成神经细胞的研究进展

秦厉梅 刘黎青 周盛年 王 媛 (山东中医药大学，山东 济南 50355)

帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化病、脊髓损伤、脑外伤、脑卒中等均由于分化成熟的神经细胞不能分裂增殖，无法弥补损伤或死亡的细胞。这些疾病的病理表现无一例外都涉及神经细胞的丢失，且丢失的细胞得不到新生细胞的补充，故治疗这些疾病的最佳途径就是诱导多能性干细胞分化形成各种类型的神经细胞，然后进行细胞移植治疗，以替代那些丢失的细胞，使神经功能恢复。1998年Thomson等和Gearhart各自成功建立了人的胚胎干细胞(ESC)系，使人们看到了用ESC治疗人类疑难疾病的曙光。自从建系以来，ESC的研究领域取得了不少可喜的成绩。目前大部分ESC体外诱导分化的细胞类型主要集中在心肌细胞、肌细胞、内皮细胞、造血细胞和神经细胞等，而ESC的神经诱导分化一直是干细胞研究领域的热点〔1〕，故本文将近年来ESC向神经细胞诱导分化的研究进行综述。

1 ESC的来源及特性

ESC是来源于着床前囊胚期的内细胞团(inner cellmass，ICM)或早期胚胎原始生殖嵴的原始生殖细胞(primordialgerm cell，PGC)的一种多潜能细胞，具有体外无限增生和高度自我更新能力的两个显著特征〔2〕。

形态学上，ESC具有与早期ESC相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色，ESC呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。

ESC系的特征包括:①能大量繁殖并保持未分化状态;②在一定条件下具有向3个胚层组织和细胞分化的全能性;③能够形成嵌合体动物，即ESC具有种系传递功能;④易于进行基因改造操作〔3〕。

2 ESC向神经细胞的诱导分化

2.1 ESC体内向神经细胞的分化 ESC植入机体后的分化方向受局部微环境的影响较大。将维甲酸(RA)诱导后的小鼠B5 ESC植入视网膜变性的rd1小鼠的玻璃体，6 w后可观察到植入细胞已经整合到视网膜内层，达到与视网膜的神经细胞组成一致的情况:大多数分化为神经元，少量为星形胶质细胞，并且没有少突胶质细胞形成〔4〕。将用RA特定处理的ESC移植到脱髓鞘模型的大鼠背侧脊髓，一段时间后发现大量的ESC存活并且在髓鞘部位分化为少突胶质细胞，形成髓鞘〔5〕。

2.2 ESC体外向神经细胞的分化

2.2.1 RA诱导 RA在ESC诱导分化过程中起了非常关键的作用。RA诱导的细胞表现了多种神经细胞特征。在经过4 d的RA诱导后，ESC出现了神经样细胞:细胞胞体小，并有一些长的突起。单抗染色细胞表达了神经微丝的M亚单位及Ⅲ型β－微管蛋白。与神经功能密切相关的蛋白基因也在诱导后表达上调，如神经递质合成酶(GAD和TH)、递质受体亚单位(GluRs)和细胞骨架亚单位(NF－1)。电生理也显示了细胞具有与神经递质功能性受体有关的电压控制的Na+、K+、Ca2+的离子通道〔6〕。

2.2.2 基质细胞源性诱导法(SDIA) SDIA可将小鼠ESC向神经细胞诱导分化。将小鼠的ESC与骨髓来源的基质细胞(PA6)放在一起共同培养1 w，90%以上的ESC可被诱导分化为神经前体细胞和神经元〔7，8〕。SDIA法不但操作起来简单，而且其中的神经分化快速有效，经SDIA处理的小鼠ESC可分化为含量高达30%的中脑多巴胺能神经元，将其植入小鼠体内后不仅可以存活，还能与宿主细胞建立神经网络〔9〕。

2.2.3 生长因子诱导 在ESC体外培养的培养基中加入特定的生长因子后，能促进ESC向特定神经细胞分化，如白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成纤维生长因子－2(FGF－2)、表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和胰岛素等〔10，11〕。卵磷脂－脑源性神经生长因子(PCBDNF)比BDNF对神经前体细胞有更好的亲和力，它可以通过加强 TrkB受体表达，提高 Mash－1、p35、NF68的表达，从而促进神经的分化〔12〕。

2.2.4 应用谱系限制性发育控制基因控制ESC向神经分化

谱系选择就是用某种神经干细胞所含的基因转染ESC，选择性的剔除不含谱系限制性基因的细胞，通过促进特定基因表达来获得纯的细胞系。在ESC体外培养的早期即可有效快速诱导神经细胞分化，其作用强于RA。

核受体相关因子－1(Nurr1)是基因转录因子的一种，其可促进中脑神经前体细胞分化为多巴胺能神经元。将全长的大鼠Nurr1 cDNA克隆到质粒中，再将小鼠ESC转染，使得分化细胞TH阳性率从5%上升到50%〔13〕。

2.2.5 中药诱导 有研究证明经典补益中药淫羊藿(Herba Epimedii)诱导ESC分化为神经干细胞的过程中，采用Western印迹法对神经细胞特异性蛋白胆碱乙酰基转移酶(Choline acetyltransferase，ChAT)、神经元特异性骨架蛋白 β－TublinⅢ进行检测。结果显示，随着ESC的分化发育，ChAT、β－TublinⅢ的表达呈逐渐增加的趋势。β－TublinⅢ在悬浮培养至第8天的拟胚体中表达明显增加，贴壁分化5 d后，表达量继续增加，后趋于稳定;胆碱能神经标志蛋白ChAT则在贴壁分化5 d后明显增加，后趋于稳定。这些证据提示了神经细胞发育的时间依赖性，贴壁分化的前5 d是药物诱导ESC分化为神经细胞的关键时间窗。淫羊藿素(icaritin，ICT)处理组细胞ChAT蛋白表达量比溶剂对照组高，提示ESC能够分化发育为胆碱能神经，ICT对此过程具有一定的促进作用。

淫羊藿的主要成分淫羊藿苷(icaritin，ICA)为异戊烯基黄酮苷类化合物，其在体内的代谢组分为淫羊藿素(ICT)和去甲淫羊藿素(desicaritin，DICT)，ICT具有促进ESC体外定向分化为神经细胞的作用，ICT引起的p38的低磷酸化水平是ICT诱导ESC分化为神经细胞的可能机制〔14〕。

3 ESC的研究前景

近年来ESC来源的细胞在移植领域的研究逐渐成为一个焦点。ESC诱导形成的神经细胞可作为细胞移植的最佳对象。随着社会老龄化的到来，神经系统退化性疾病在人类疾病中的比重越来越大。通常认为，神经细胞不可再生，故以往的研究基本都集中在改善神经系统损害症状并防止进一步损害的治疗方法上。ESC能够成功诱导分化为神经细胞的，为神经系统疾病的治疗打开了崭新的一页。但此技术如果应用到临床上，其所需要的细胞来源必须具备:供体细胞来源丰富，安全可靠，纯度较高，移植的细胞能产生所需的神经谱系细胞，且不产生免疫排斥等条件〔15〕。

添加诱导剂RA后的神经诱导效率很高，可达90%以上，但是诱导后的细胞成分不纯，杂细胞太多，存在的神经细胞大多是神经元与神经胶质细胞，并且神经元所占的比例不大。SDIA虽然操作简单，神经分化也快速有效，但在机体应用却不太方便。生长因子造价高，费用昂贵，不适宜大规模的推广应用。应用谱系限制性发育控制基因控制ESC向神经细胞分化的方法则要求必须将基因插入到基因组的正确位置和分化的恰当阶段活化，才能获得想要的结果。并且由于人为地介入基因组可能导致基因组的不稳定，从而导致下游基因的异常表达。

利用中药诱导ESC向神经细胞分化具有操作简单，价格低廉等优点，具有广阔的应用前景，但中药诱导出的神经细胞是不是具有神经细胞所具有的完整的功能，是否可完全替代机体的细胞等问题，都有待进一步的研究和探讨。中医药博大精深，中药制剂尤其是中药汤剂或提取液进行诱导的实验还并不普遍，如果加强这方面的研究，必将取得可喜的成绩。相信ESC诱导形成神经细胞的应用前景是不可估量的，它必将在临床应用中发挥巨大作用。

1 袁 丁.3种培养体系下人胚胎干细胞神经诱导分化的比较〔J〕.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010;38(4):31－6.

2 李英博.体外诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展〔J〕.神经解剖学杂志，2004;20(6):633－6.

3 刘建中.胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展〔J〕.研究进展，2007;4(18):8－9.

4 Meyer JS，Katz MI，Maruniak JA，et al.Neural differentation of mouse embryonic stem cells in vitro and after transplantation into eyes of mutant mice with rapid retinal degeneration〔J〕.Brain Ras，2004;1014(1):131－44.

5 Liu S，Qu Y，Stewart TJ，et al.Embryonic stem cells differentiation into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(11):6126－31.

6 沈 干，丛笑倩.胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的研究〔J〕.国外医学·生物医学工程分册，2002;25(4):150－6.

7 Kawasaki H，Suemori H，Mizuseki K，et al.Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cellderived inducing activity〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99(3):1580－5.

8 Wichterle H，Lieberam I，Porter JA，et al.Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons〔J〕.Cell，2002;110(3):385－97.

9 徐海伟，吴 旋.胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展〔J〕.第三军医大学学报，2003;25(3):267－9.

10 唐 军，曹 娟.胚胎干细胞诱导分化为神经细胞治疗帕金森病的前瞻于现状〔J〕. 中国临床康复，2003;7(25):3503－5.

11 Tropepe V，Hitoshi S，Sirard C，et al.Direct neural fate specification from embryonic stem cells:a primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism〔J〕.Neuron，2001;30(1):65－78.

12 Kitagawa A，Nakayama T，Takenaga M，et al.Lecithinized brain derived neurotrophic factor promotes the differentiation of embryonic stem cells in vitro and in vivo〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;328(4):1051－7.

13 Kim JH，Auerbach JM，Rodriguez－Gomez JA，et al.Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson′s disease〔J〕.Nature，2002;418(4):50－6.

14 王志强.异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂的神经保护和促胚胎干细胞分化为神经细胞的研究〔D〕.浙江大学博士学位论文，2007:2－83.

15 薛亚梅，王 锋.胚胎干细胞向神经细胞定向诱导分化方法的研究进展〔J〕. 中国畜牧杂志，2005;41(8):58－60.