松材线虫病病原学研究的几个问题

叶建仁，黄麟

(南京林业大学森林资源与环境学院，江苏省有害生物预防与控制重点实验室，江苏南京 210037)

松材线虫病又称松树萎蔫病，可在短时间内导致松树死亡，是松树上的一种毁灭性病害。该病寄主包括黑松、赤松和马尾松等数十种松属植物，也危害少数非松属针叶树［1］。日本1905年首次报道了该病在长崎县引起松树大面积枯死。目前该病分布于美国、加拿大、墨西哥、葡萄牙、韩国、日本及中国等多个国家，其中在日本、中国和韩国发生最为严重［2-3］。我国自1982年在南京中山陵首次发现该病短短30年时间里，疫情已扩大到江苏、安徽、广东、浙江、山东、福建、江西、广西、四川等16个省区，每年发生面积近10万hm2，累计致死松树5 000多万株，直接经济损失25亿元，间接损失250亿元。近年来疫情扩散蔓延呈加剧之势，已逼近黄山等著名风景名胜区、世界自然文化遗产地和重点生态区域，对我国大面积松林构成严重威胁，是我国最具危险性的头号森林病害［4］。该病涉及到寄主松树、线虫、天牛、真菌、细菌以及环境因素等多个方面［5-6］，至今其致病机理尚未完全弄清，对其治理也较为被动，还没有特别有效的防治措施。病原学的深入研究是揭示松材线虫病致病机制和流行规律的前提，也是科学有效实施防治的基础。关于该病的病原、致病分子机理等基础性问题的研究有助于突破松材线虫病研究中长期未能解决的关键问题，为该病的科学防控提供理论基础。

1 松材线虫病的病原

关于松材线虫病的病原，长期以来松材线虫被认为是该病的惟一病原，接种实验发现松材线虫能引起松树萎蔫［7-9］。在接种的早期阶段即树脂分泌停止阶段，松树体内线虫量较少;当松树针叶变黄时树体内线虫的虫口数快速增长，病情逐渐恶化;松树死后线虫数量又逐渐减少［10］。将松材线虫经制霉菌素、青霉素消毒后得到无菌线虫，接种实验证实无菌线虫的致病性并未丧失［11］。研究还发现接种黑松1周后黑松的水分输导即受阻，但松树体内的微生物相和健康松树相似，直至接种5周后，蓝变菌开始出现，细菌才开始增多，因此认为接种松材线虫的致病性与其它微生物无关［12］。最新的研究发现从卵阶段就开始无菌化处理获得的无菌线虫，在无菌条件下对无菌组培苗的致病性测定表明，无菌松材线虫及带菌松材线虫接种均能使赤松和湿地松无菌苗发生萎蔫，无菌化处理并未使松材线虫丧失致病性，而松材线虫体表细菌单独接种未能使无菌苗发病。无菌松材线虫在发病植株体内大量繁殖，病株体内的线虫回收后依然保持无菌状态［13］，这些工作表明松材线虫可以单独引起松树萎蔫，松材线虫是导致松树发病的直接原因。

早期的研究发现感染松材线虫病的病木生理和组织病理学变化往往在线虫数量快速增长之前出现，因此推测可能其他因素参与了该病的病理学过程，并认为松材线虫携带的产毒素细菌 Pseudomonas spp.可能在松材线虫病中发挥作用［14-15］。后来的研究发现，松材线虫携带包括细菌和真菌在内的大量伴生微生物类群［16-18］。有研究认为松材线虫携带的伴生细菌在该病的病程中发挥重要作用，该病是由松材线虫和伴生细菌共同引起的复合侵染病害。该观点认为松材线虫病是松材线虫与其体表携带的致病细菌共同侵入寄主，致病细菌分泌毒素导致寄主萎蔫和死亡。松材线虫携带细菌侵入树体后，线虫在为致病细菌提供营养和保护作用，而致病细菌在产毒和促进线虫繁殖等方面起重要作用，二者对诱发寄主的萎蔫和死亡缺一不可。松材线虫的无菌化处理会导致其致病性减弱，甚至完全丧失其致病性［19-26］。

但是目前松材线虫携带细菌致病的观点存在较大争议。如很难对松材线虫的致病性分化，特别是对同一地区的松材线虫的致病性分化做出合理的解释，在自然条件下存在部分松材线虫虫株完全丧失了致病力的现象，其中虫株C14-5就是被广泛使用的松材线虫的无毒突变株［27-32］。另外，松材线虫虫株间携带细菌种类和数量差异较大［33-36］。不同地区、不同寄主体上致病力相同的虫株，它们所携带的细菌种类和数量可能是不同的，或致病力不同的虫株可能带有相似的细菌菌株。目前的研究没能从具有致病力不同的线虫虫株体表获得有相同的或共同的优势细菌种类，因此很难做出其与致病性相联系的合理解释。此外，该观点也无法很好的评价松材线虫作为一种植物线虫在松树体内的取食、移动、繁殖以及松材线虫及其代谢产物与寄主植物互作过程中可能引起的植物细胞的破坏及病变反应在病程发展中的作用。植物线虫对植物的致病作用已经有大量的实验证实［37-38］。因此，关于松材线虫携带的细菌在松材线虫病的致病过程中的作用，哪些细菌在松材线虫的体表是普遍存在的，这些细菌是如何影响或发挥致病作用的，都还需要大量的研究给予进一步的证实。目前国内外大量的有关松材线虫病的致病性形成机制的研究工作主要还是将松材线虫作为松材线虫病的病原来展开的［39］。

2 松材线虫致病性相关基因的研究

2.1 食道腺在松材线虫致病中的作用 线虫在侵染寄生过程中，用口针刺入植物组织中，食道腺分泌物通过口针注入植物细胞，这些分泌物可以改变细胞质以利于取食。与其他植物线虫一样，松材线虫的食道腺位于其身体的前端，包括1个背食道腺和2个亚腹食道腺细胞［40］。线虫食道腺分泌物含有高浓度的蛋白，在不同的寄生阶段和不同的食道腺中蛋白的种类和数量均有差别［41-42］。食道腺分泌的蛋白可能在植物线虫不同的寄生阶段具有不同的作用，在线虫侵染寄主植物的早期亚腹食道腺分泌的蛋白起主要作用，而在线虫寄生后期亚腹食道腺开始萎缩，背食道腺活性明显增加［43-44］。分泌物对植物细胞及其内含物的修饰作用，有利于植物线虫的取食与移动［41］。因此，基因表达位点分析可以作为植物线虫致病基因功能分析的重要参考，如某些植物线虫致病基因的作用位点在食道腺细胞，那么它们可能就与植物线虫的取食、寄生和对寄主植物的致病性密切相关。目前，分析基因的表达位点可以通过对mRNA的原位杂交［45］以及针对蛋白的原位免疫荧光分析［46］确定。在对南方根结线虫的研究中，采用微吸法获得食道腺细胞内含物并构建了食道腺特异表达的cDNA文库，获得包括185个含有信号肽序列的线虫分泌蛋白cDNA的2 452个克隆，经高通量的原位杂交的方法鉴定了37个含有信号肽序列，其中13个基因在亚腹食道腺表达，24个在背食道腺表达，并推测这些基因可能在南方根结线虫致病过程中发挥重要作用［47］。

2.2 松材线虫的致病相关基因克隆 植物线虫在侵染植物过程中需要抵御寄主植物的防卫反应，通过在寄主体内取食和移动等来维持正常的生长发育和繁殖。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的涉及线虫在寄生过程中与致病相关的基因被克隆，这些基因的功能研究有助于对植物线虫的寄生、致病机理做出科学的推测及阐释。

2.2.1 内 切 β-1，4-葡 聚 糖 酶 (β-1，4-endoglucanase) 植物细胞壁是植物抵御病原菌的物理屏障，病原物通过分泌细胞壁降解酶分解寄主植物细胞壁，侵入寄主植物组织，并从其酶解过程中获得生长发育、繁殖及定殖于寄主植物必需的营养物质。植物细胞壁主要成分是纤维素，一些植物病原细菌和病原真菌，通过自身分泌的纤维素酶破坏植物组织细胞壁纤维素来侵染寄主植物［48-49］。植物线虫的研究表明植物线虫分泌物中也含有大量的纤维素酶蛋白，该类蛋白参与了植物线虫对植物细胞壁的修饰作用，是一类植物线虫重要的致病因子［50-52］。

纤维素酶包含有14个糖基水解酶家族，其中有5 个(GHF5，6，9，10，45)在动物研究中有报道，它们在系统进化上有明显差异。利用松材线虫虫卵与虫体的抑制消减杂交与RACE技术相结合的方法从松材线虫中克隆的内切β-1，4-葡聚糖酶基因ENGL1，全长cDNA为797 bp，包含1个675 bp的开放阅读框，5′非翻译区长24 bp，不含有线虫剪接引导序列SL1，3′非翻译区长97 bp，含有加尾信号序列TATAAA。ENGL1含有1个 N-糖基化位点(84 NLSY)、5个蛋白激酶磷酸化位点、5个酪蛋白激酶II磷酸化位点、6个N端酰基化位点、1个酰胺化位点和1个Prokaryotic membrane lipoproteinlipid attachment site和1个糖基水解酶GHF45家族活性位点(21 TTRYWDCCKPSC)。ENGL1含有2个低复杂度区域，分别为 4Lys-15Ala，58Gly-70Ser(53)。ENGL1与数据库中松材线虫内切β-1，4-葡聚糖酶蛋白 ACD12136，BAD34546，ACN42745的相似性分别为99%，91%，75%。与ACD12136的相似性最高，二者的氨基酸序列仅有3个残基差异，分别出现在ENGL1信号肽序列的6L的缺失和11D残基取代了G，以及216E残基取代了K残基。

目前在松材线虫上发现GHF45家族蛋白内切β-1，4-葡聚糖酶基因的催化活性位点与真菌短帚霉和米根霉的GHF45家族高度相似，而在自由生活线虫秀丽隐杆线虫和Caenorhabditis briggsae的全基因组中并没有发现GHF45家族基因，因此认为该类基因可能通过水平基因转移的方式从真菌中获得。真核表达产物分析表明，松材线虫的Bx-eng-1是以非糖基化的单体形式存在，而Bx-eng-2和Bx-eng-3是以糖基化的二聚体形式存在，体外表达产物的酶学性质分析表明三者具有相似的酶学特性，其最适的pH为6.0，最佳活性温度为60℃［53-54］。RNAi研究表明，dsRNA浸泡24 h能显著导致该基因的转录后基因沉默效应，降低其纤维素酶活性，同时浸泡处理能显著减少F1的线虫个体数量，因此认为该基因可能在松材线虫的致病性和线虫的取食、发育和繁殖中发挥作用［55］。

2.2.2 内 切 β-1，3-葡 聚 糖 酶 (β-1，3-endoglucanase) β-1，3-葡聚糖酶催化水解 β-1，3-D-葡聚糖糖苷键，内切 β-1，3-葡聚糖酶和外切 β-1，3-葡聚糖酶两大类。该类酶广泛分布于细菌、真菌和高等植物。细菌β-1，3-葡聚糖酶的功能主要是真菌细胞壁的降解从而有利于细菌的营养摄取;真菌中该酶参与真菌的细胞发育与分化，并在植物病原真菌与寄主的互作中发挥重要功能;植物中的参与了植物细胞分化和对病原真菌的防御反应［56-58］。在海洋无脊椎动物和线虫中均有β-1，3-葡聚糖酶基因克隆的报道［59-60］。

Kikuchi等［61］分别从松材线虫和拟松材线虫中克隆了1个内切β-1，3-葡聚糖酶基因 Bx-lam16A，推导氨基酸序列含有明显的信号肽特征序列和GHF16家族保守序列残基，BxLAM16A与来自Xanthomonascampestris，X．Axonopodis，Pseudomonas sp.的β-1，3-葡聚糖酶的相似性达到了49%～43%。BxLAM16A体外表达产物酶活性分析发现，该酶对可溶性的β-1，3-葡聚糖昆布多糖的水解活性最高，β-1，3-1，4-交联葡聚糖表现出较低活性，β-1，4-交联葡聚糖底物无催化水解活性。该酶活最适pH为4.9，最适温度为65℃，该蛋白的表达位点为食道腺细胞，推测该基因可能参与了松材线虫对植物细胞壁的修饰作用。序列同源性分析表明细菌β-1，3-葡聚糖酶属于GHF16家族，而大多数植物和真菌源的β-1，3-葡聚糖酶则属于GHF17家族。系统发育树分析发现BxLAM16A与来自细菌的GHF16家族高度同源，而与来自其他动物的系统发育关系较远，认为该基因很可能是通过水平基因转移的方式从原核生物中获得的。

2.2.3 果胶质酶 植物细胞果胶质沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使得细胞组织结构坚硬，表现出固体的形态，同时构成抵御病原微生物入侵的天然屏障［62］。果胶酶通过β-消去反应催化降解α-1，4-果胶酸盐，该反应在果胶质的降解过程中发挥了重要作用［63］。果胶酶广泛存在于植物病原细菌、真菌和线虫中，主要作用是降解植物细胞壁从而有利于病原物的侵入和定殖［63］。在植物线虫中，果胶质酶在食道腺细胞产生，通过口针分泌进入植物细胞，在侵染和致病性等方面发挥重要作用。在部分孢囊线虫和根结线虫中均有果胶质酶基因克隆的报道［64-66］。

目前从松材线虫中成功克隆了2个果胶酶基因Bx-pel-1和Bx-pel-2，推测的氨基酸序列BxPEL1和BxPEL2的N端含有明显的信号肽特征序列，与多糖降解酶家族3PL3有着较高的相似性，BxPEL1和BxPEL2的氨基酸序列相似性为64%。原位杂交分析发现Bx-pel-1在植物线虫的食道腺部位特异表达。体外重组蛋白活性分析表明，BxPEL1对聚半乳糖醛酸具有明显的催化降解活性，而对甲基化果胶质具有较低的催化降解活性，研究还发现Bx-PEL1为Ca2+依赖蛋白，其最适温度是55℃，最适pH 是 8 ～10［67］。

2.2.4 过氧化物酶(Peroxidase) 活性氧的产生在植物的免疫防卫反应和对病原物的识别中发挥着重要作用，其参与了信号传导、抑菌作用、membrane lipoxidation、细胞壁修饰、诱导抗性和细胞过敏性坏死［68-69］。而病原物则通过产生抗氧化剂来有效抵御寄主的活性氧防卫反应［70］。因此，能否清除寄主植物产生的活性氧就成为病原物能否在寄主植物体内成功定殖的关键。在真核生物中，主要的抗氧化剂包括对超氧根阴离子具有解毒作用的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX)和 Peroxiredoxin(Prx)等。有研究发现植物线虫的真皮层能够分泌一种硫氧化蛋白过氧化物酶，该蛋白具有特异代谢过氧化氢的活性，推测该蛋白可能与线虫抵御植物防卫反应有关［71］。谷胱甘肽过氧化物酶是生物消除过氧化氢抵御氧胁迫的主要方式。Prx蛋白属于抗氧化蛋白超家族，在原核生物、植物、无脊椎动物和哺乳动物中广泛存在［72］。大量的研究表明，Prx蛋白在病原物与寄主植物的互作中发挥重要作用，是许多病原物防治的重要靶标［73］。Prx作为抗氧化还原酶对过氧化氢的分解需要有氧化还原活性半胱氨酸的参与。根据其保守Cys的数目不同，可以分为2个亚家族，即1-Cys Prx和2-Cys Prx。Prx与过氧化氢酶和GPX不同，其催化活性不需要金属离子或者辅基等氧化还原因子的参与［74］。

在松材线虫中有1个Prx基因BxPrx已经被克隆，BxPrx含有2个保守的半胱氨酸位点Cp和Cr，1个threonine-cysteine-arginine催化三元体，2个对过氧化氢敏感的标签元件GGLG和YF。保守结构域分析和三维结构模拟的结果都表明BxPrx具有氧化还原功能。BxPrx尽管没有信号肽结构，但其结构中还有23个连续的疏水氨基酸形成α-螺旋的跨膜结构，BxPrx在不含有信号肽的条件下，可能依赖于这一跨膜结构或ATP结合盒转运子实现其跨膜运输。体外表达产物的酶活分析表明BxPrx在以谷胱甘肽作为电子供体的情况下表现出了对过氧化氢的还原活性［75］。

2.2.5 扩展蛋白(Expansin) 扩展蛋白是植物生长发育过程中具有调节功能的重要蛋白，该蛋白通过在植物细胞壁中的纤维素纤丝和基质多糖交叉处，以一种可逆的方式作用于微纤丝表面的基质聚合物，使多聚网络间的非共价键断裂，促进聚合物滑动，在植物细胞壁的生长和分解等方面发挥重要作用，该类蛋白在植物线虫中普遍存在［76-78］。Kikuchi等［79］从松材线虫和拟松材线虫中分离获得的扩展蛋白在食道腺细胞的特异表达，与来自马铃薯金线虫等植物线虫的扩展含有碳水化合物结合位点不同，在松材线虫和拟松材线虫的扩展蛋白中不含有类似的结合位点，推测该基因参与了寄主植物与植物线虫的互作，最有可能在协助线虫在植物体内的移动方面发挥重要作用。

2.2.6 毒液过敏蛋白(Venom allergen-like protein)

毒液过敏蛋白作为SCP蛋白家族成员，在真核生物中普遍存在，在其结构中含有SCP/TAPS保守结构域，许多含有这一结构域的蛋白为胞外泌出蛋白［80-81］。研究发现该类基因在大豆孢囊线虫和南方根结线虫等植物线虫的寄生阶段高量表达，但其功能尚不清楚［82-84］。

从松材线虫中克隆了3个类毒液过敏蛋白Bxvap-1，Bx-vap-2，Bx-vap-3，表达位点都位于松材线虫的食道腺细胞。结构分析发现3个基因都含有信号肽特征序列及SCP/TAPS保守序列，表达量分析发现Bx-vap-1在松树体内的繁殖型阶段的虫体上表达量最高，dsRNA介导的Bx-vap-1基因沉默显著降低了松材线虫在松树体内的迁移速率［85］。因此，该基因的功能可能协助线虫在树体内的迁移，参与了植物线虫抑制寄主植物的防卫反应。

3 松材线虫病流行的病原学研究

收集我国1982-2005年间松材线虫病疫情普查数据、专项调查报告、疫情分析报告、国家报告等资料，应用地统计学和克里格插值方法分析松材线虫病在我国的空间分布结构和空间相关性。在全国和江苏、安徽、广东、浙江5个不同空间尺度下，松材线虫病发生疫点的空间半变异函数均为球形，在空间格局上呈聚集分布。松材线虫病在中国有着2个明显的聚集分布区域，一个位于30.5～32.5 N，117.7～120.5 E，以南京为中心，包括江苏、安徽大部和浙江西北部;另一个位于22.5～24 N，113～114.5 E，在广东境内［86］。

对收集自我国13个省、49个县(市、区)的173个松材线虫虫株以及南京林业大学江苏省有害生物预防与控制实验室保存的部分来自美国、日本的松材线虫虫株和拟松材线虫虫株的RAPD分析及遗传多样性分析表明，松材线虫与拟松材线虫种间与种内都存在着较高的遗传多样性，且二者种间的遗传变异大于种内。中国松材线虫群体间的遗传相似性较高，平均在0.9以上，与日本的平均遗传距离是0.274 2，与美国的是0.424 2，中国群体与日本群体的亲缘关系比与美国更为接近。山东长岛群体与日本群体的遗传距离仅为0.15［87］。

松材线虫的遗传多样性分析同样证实我国存在以广东和江苏为中心的2个聚集分布区，但2个聚集分布区形成原因迥异，苏皖聚集分布区域的形成是松材线虫病传入南京后依靠自然或人为因素不断围绕始发区域向外扩散的内源性扩散所致，区域内各疫点松材线虫具有较高的同源性，很可能来自同一个疫源。广东聚集分布区各域疫点间松材线虫的遗传特性具有一定的异质性，其形成主要体现为外源性，是由于区域外松材线虫的不断入侵所致［87］。

根据各线虫虫株的遗传相似性模拟的松材线虫在我国可能的传播路径发现，安徽松材线虫疫源最初很可能来自江苏，此后在全省范围内流行。广东松材线虫病可能存在不同的源头，东莞市和韶关市乳源县疫情最有可能来自浙江宁波的象山市，惠州市惠城区和广州增城市的松材线虫可能分别源自不同的国外地区。象山市疫点疫源最有可能来自安徽，杭州富阳市可能有2个分别来自国外的疫源。江西赣州市章贡区疫情最有可能来源于安徽马鞍山。湖南益阳市松材线虫可能分别来源于国外、浙江和贵州等3个不同区域。广西桂林和防城港两地疫情均可能来自象山市。湖北恩施市松材线虫最有可能由安徽马鞍山、明光等地传入。贵州遵义县松材线虫可能来源于浙江舟山市普陀区。四川邻水县松材线虫与全国大部分地区松材线虫具有较高的同源性，从浙江、江苏和广西传入的可能性大。重庆松材线虫来源于安徽、广西、浙江和江苏的可能性较大。山东省松材线虫来自于日本［87］。以上可能的疫情传播路径充分反映了松材线虫病疫情主要依赖于人为因素传播而呈现出跳跃式发展的特点。Cheng等［88］早期采用AFLP对来自我国的松材线虫28个虫株、美国4个虫株和日本2个虫株的遗传多样性分析与可能的传播路径分析认为，该病的疫情最早起源于广东，一条传播路径是由广东传播至安徽、浙江;另一条是由广东传入江苏，再至湖北、重庆、贵州和安徽明光地区。两种观点都认为广东是松材线虫病疫情在我国流行的一个重要的传播源。但也存在差异，后期的研究认为江苏也是该病另外一个传播源，造成这种差异的原因可能与疫情后期的进一步发展和样本收集数量进一步丰富有关。

松材线虫病疫情数据的统计结果分析也表明，该病在我国的传播方式以人为成分为主。人为传播载体中，37.66%是由于调运感病松木携带传入，41.56%是随货物包装流通传入，18.18%是由于实施电网改造工程时大量电缆盘携带传入，2.60%是架设通讯设备时光缆盘携带传入。其在我国快速扩散蔓延是由大量携带病原的木包装材料境外传入、国内疫区疫木管理不严、检测检验手段落后、疫情监测不及时等原因共同造成的［87］。

4 展望

4.1 松材线虫伴生微生物的多样性 自然界松材线虫存在伴生微生物是一种普遍现象，有关松材线虫与伴生真菌的研究认为伴生真菌在松材线虫病的后期阶段松树细胞死亡后可以作为线虫的饲料维持线虫正常的种群繁衍，伴生真菌也可以通过松材线虫及其传播媒介在天牛羽化阶段实现真菌生存领域的扩展和种群的扩张，二者形成互惠关系［89-92］。关于细菌与松材线虫的关系，特别是与松材线虫致病性的关系目前还存在争议，正如前文所述。同时关于松材线虫伴生细菌的携带部位，早期的研究认为松材线虫的伴生细菌只分布在松材线虫的体表，而在体内没有观察到细菌的存在［93］。但最近的研究认为松材线虫和拟松材线虫的肠道区内均有细菌的存在，并且从体表无菌的松材线虫和拟松材线虫分离获得了线虫体内细菌，包括寡养单胞菌属Stenotrophomonas和爱文氏菌属Ewingella在内的细菌类群［94］。但关于松材线虫体内细菌存在的普遍性与获取方式以及体内细菌对松材线虫的影响、与线虫的协同进化等诸多方面的研究都有待于进一步深入。

4.2 松材线虫的功能基因的研究与利用 松材线虫基因组测序工作初步完成，测完18 000多个基因，为揭示松材线虫的致病基因奠定了重要基础［39］。为了充分阐明松材线虫病的分子机制，还有必要在已知基因组信息的基础上借助松材线虫的转录组测序与表达谱分析，特别是结合该病的病程筛选松材线虫及与寄主互作过程中的病程相关效应因子，这无疑是松材线虫致病机制的关键环节。目前，多种植物寄生线虫大规模的EST测序以及cDNA文库的测序为植物寄生线虫致病相关的基因的研究提供了数以万计的表达序列标签［47，64，66，95］，结合基因组表达谱分析及其他模式生物的功能基因注释信息，获得了包括果胶裂解酶［66］、多聚葡聚糖醛酸酶［96］、β-1，4-木聚糖酶［97］和 β-1，4-内切葡聚糖酶［98］在内的大量植物寄生线虫致病相关基因。其中松材线虫的混合阶段、分散型幼虫阶段转录组分析，以及松材线虫和拟松材线虫转录组的比较分析［95，99］，为松材线虫的致病性、发育、生态适应性等性状相关功能基因的挖掘与利用提供了重要的材料。

随着松材线虫基因组和转录组的测序，数据库中积累了大量松材线虫的基因序列信息，但目前仅有非常有限的基因获得了明确的功能注释。目前从松材线虫克隆的与致病性相关的基因主要有细胞纤维素酶GHF45家族、果胶酶、扩展蛋白、毒液过敏蛋白、过氧化物还原蛋白等基因［75，79，85，100-101］。关于这些基因的功能分析大都采用同源性比对和体外表达产物的酶学分析方法进行，但这类方法只能满足于某些酶类的功能分析，而对一些非酶类的基因功能分析则受到很大限制。此外由于酶学功能分析大多借助于原核和真核体外表达系统进行，因此也很难完全阐明该基因的确切功能以及该基因在宿主体内的差异表达可能导致宿主的表型变化。近年来，随着RNAi干扰技术在植物线虫基因功能分析方面的应用发展，也被用于松材线虫基因功能的鉴定［55，76，102-104］。尽管目前已经有部分学者开展了松材线虫部分催化酶的 RNA 干扰研究［55，103-104］，但还没有关于松材线虫致病相关基因RNA干扰后松材线虫致病力变化的报道，特别是干扰后线虫对松树的致病力的变化。此外，目前的报道大多基于浸泡法进行松材线虫的RNA干扰，但由于浸泡法具有不持续性和干扰效果逐步衰退的劣势，使其应用受到很大限制。松材线虫有不同于秀丽线虫和其他植物寄生线虫的特性，松材线虫在离体条件下具有取食部分真菌菌丝的特点，这就使得构建由真菌介导的高效、稳定的RNAi干扰体系成为可能。可被松材线虫取食的真菌包括灰葡萄孢、拟盘多毛孢、盘多毛孢等多种真菌［105］。初步研究表明异角状拟盘多毛孢真菌遗传转化体系的建立为今后探讨由真菌饲喂法实现松材线虫功能基因的持续高效的RNAi干扰效应成为可能［106］。

功能基因的正确表达调控作为基因功能实现的重要方面，siRNA、miRNA及其他小RNA等非编码RNA参与了生命活动的基因的表达调控，其中包括转录、染色体的形成、RNA的剪接和修饰、mRNA的稳定和翻译、蛋白质的稳定和转运，其中miRNA的表现尤为突出。miRNA在动植物、微生物的生长、发育、繁殖、致病等方面发挥重要作用。在秀丽新杆线虫中发现部分miRNA在线虫的发育过程具有重要的调控作用，同时也为研究线虫的转录后调控研究提供了重要借鉴［107-108］。在松材线虫的研究中目前仅见Huang等［109］通过深度测序的方法分析了不同地理来源的松材线虫miRNA，共发现了810个miRNA，其中含有保守的miRNA 49个。miRNA可能在松材线虫的生态适应性和进化中具有重要作用。但关于这些miRNA的靶标基因及其对靶标基因的调控等方面的研究还未见相关报道。致病相关基因的表达调控研究是研究松材线虫致病分子机制的重要方面，由于miRNA在基因的表达调控方面，尤其是mRNA的转录后调控具有重要的作用，也将是松材线虫致病机制研究的重要方面。

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